[发明专利]一种可用于外源基因表达的载体及细胞株筛选方法

说明书

发明领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，本发明涉及采用DNA重组技术在哺乳动物细胞中高效表达的载体，一种将目的基因表达和筛选基因潮霉素B磷酸转移酶表达紧密连接在一起的技术，一种弱化扩增基因DHFR的表达来提高MTX筛选效率，降低MTX使用浓度的技术。本发明还涉及采用以上技术优化的表达载体转染细胞后，获得高水平表达克隆的筛选方法。

发明背景

为了获得与功能和药代特性相一致的蛋白翻译后修饰，生物药物蛋白需要用哺乳动物细胞来作为其表达宿主细胞。常用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠肾细胞(CHO)，BHK细胞和杂交瘤NSO细胞等。而CHO细胞由于其可在无血清或无蛋白的培养基中高密度生长，并已证明为安全的生物药物蛋白生产细胞而被广泛使用。CHO稳定表达系统已开发了二氢叶酸dhfr扩增系统和谷氨酰胺合成酶GS扩增系统。这两种系统可获得高水平的表达，但由于GS系统涉及Lonza公司专利知识产权，高昂的知识产权费使其只能在少数几个大的制药公司中应用，CHO-dhfr系统仍是主流的生物药物蛋白生产细胞株。

异源目的基因需要与一个筛选基因(比如潮霉素B磷酸化转移酶)一起重组到细胞系基因组上，通过筛选基因的筛选获得的稳定细胞株可表达目的蛋白。异源目的基因和筛选基因通常放置在相同或不同表达载体上，一个或两个不同的载体转染或共转染细胞后，加入抗生素，比如hygmycin进行筛选，细胞培养数周后，抗生素耐受的生长克隆可检测目的蛋白的表达水平。由于整合到不同的基因组位置，不同细胞表达目的蛋白的能力差异很大，并且还有大量细胞株只整合了抗生素基因，而没有整合进入目的基因。因此，为了获得目的基因整合到高表达位点，通常需要高通量ELISA检测大量的抗生素耐受克隆来获得少量的高表达克隆。

基因扩增可使蛋白表达水平得到大幅度的提高而在重组生物蛋白药物的生产中广泛使用。以二氢叶酸还原酶(DHFR)为基础的基因扩增系统广泛应用于DHFR缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系统中。可将目的基因和dhfr筛选基因放置于一个或两个不同的载体上，转染细胞后，在不含甘氨酸，次黄嘌呤和胸腺嘧啶的培养基中进行筛选。然后再逐步加入不同浓度的二氢叶酸还原酶抑制剂，甲氨喋呤(MTX)来扩增基因拷贝，提高蛋白的表达能力(Kaufman，R.J.et al.，JMol Biol，1982，159，601-621)。高浓度的MTX可扩增基因提高蛋白表达能力，但基因的表达水平也极容易在长期培养中丢失，而使得目的基因的表达量非常不稳定。因此这需要从大量的细胞扩增筛选中，才能获得极少数的稳定高表达的细胞株，这需要耗费大量的人力和时间。

目前，已有开发了多种商业化的哺乳动物的表达载体，许多优化的载体都主要看重蛋白表达水平的提高，比如采用强病毒启动子如CMV，SV40来增强目的基因表达的启动(Barbara S.C.et al.，Nucleic Acids Research，1991，19(14)，3979-3986；Daniel J.L.et al.，Protein Expression andPurification，2002，20，500-506)或采用新的NPT筛选系统(KerstinSautter，Wiley InterScience，2005，530-538)。但优化CHO表达载体更应看重的是：提高效率，降低浪费在低表达或无表达克隆的工作量，提高高蛋白表达克隆的筛选几率，这样将可减少制药的经济成本和时间成本。Raju K.K.et al.，Gene，2001，280，87-95的文章中提到将目的基因定向重组到热点表达的基因组上，他在载体上放入了5kb的一段基因组转录活化区域，与目的基因和dhfr基因共同构建在一个载体上。转染细胞可明显的降低筛选工作量和提高基因重组的稳定性。WW Hong et al.，Vaccine，2007，25：4103-11报告的文献中将CHO表达载体与DHFR RNAi沉默基因的载体进行共转染，这个方法能明显降低dhfr基因的表达水平，在dhfr缺陷型或dhfr正常表达的细胞株中都获得高表达的细胞系。Brian K.L.et al.，Nucleic Acids Research，1996，24(9)，1774-1779发表的文献中，将dhfr基因放置于强启动子和目的基因之间的内含子内，该结果可明显减少耐受高浓度的细胞数量，提高耐受克隆的表达量。因此，优化载体来获得高水平并且稳定表达的细胞株，减少筛选的工作量和工作时间是非常需要的优化方向。

发明内容