[发明专利]总RNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种优化了的植物材料总RNA提取的方法。

背景技术

目前，常见植物材料总RNA的提取方法较多，主要有SDS-Phenol法、CTAB法、Trizol法、异硫氰酸胍法、热硼酸法等，这些方法在提取过程中都要用到有机溶剂（平衡酚，氯仿）抽提去除材料中的蛋白质、DNA、多糖、多酚等有机类物质，因有机溶剂大都具有很强的致癌性，毒性较大，且严重污染了环境。还有些RNA提取方法步骤中即使用酸性酚抽提去除蛋白质和DNA，但效果并不理想。我们迫切需要一种成本低廉，操作简单、方便，对环境无污染，对人体危害小，且完全不用有机溶剂抽提，就能彻底除去材料中的蛋白质、DNA、多糖、多酚等有机类物质的提取方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种对环境无污染、不用有机溶剂抽提，就能彻底除去植物材料中蛋白质、DNA、多糖、多酚等有机类物质的总RNA提取方法。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案是：总RNA提取方法，步骤为：

（1）取新鲜植物材料在液氮环境下充分研磨成细粉状，快速转移到含有细胞裂解液的离心管中，震荡5-15秒后室温放置3-7分钟；

（2）向步骤（1）中的离心管中加1/3细胞裂解液体积的蛋白质-DNA沉淀溶液，上下颠倒混匀，4℃放置5-15分钟后，离心5-15分钟；

（3）转移上清液到新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒离心管混匀，室温放置5-15分钟，离心5-15分钟；

（4）弃上清液，用体积浓度70%-80%乙醇洗涤沉淀，室温空气干燥3-5分钟，加DEPC水稀释的DNA酶I溶液，37℃水浴10-20分钟；

（5）加DEPC水和盐酸胍溶液，上下颠倒混匀，离心3-7分钟；

（6）转上清液到新的离心管，加沉淀浓度为1.5-2.5mol/L的LiCl溶液，上下颠倒混匀，-20℃静置20-40分钟或4℃静置10-12小时；

（7）离心20-40分钟，用体积浓度70%-80%乙醇洗涤沉淀，室温空气干燥3-5分钟，溶解在DEPC水中低温保存。

按上述方案，所述的离心最大转速为14000rpm。

按上述方案，所述的细胞裂解液为2% (w/v)的SDS 、68 mmol/L的柠檬酸钠、132 mmol/L的柠檬酸、1mmol/L的EDTA和0.5 g/L的三盐酸亚精胺。

按上述方案，所述的蛋白质-DNA沉淀溶液为4 mol/L的 NaCl 、16 mmol/L 的柠檬酸钠和32 mmol/L 的柠檬酸。

按上述方案，所述的LiCl溶液为8mol/L。

按上述方案，所述的DEPC水稀释的DNA酶I溶液的浓度为0.5 units/μl。

按上述方案，步骤（1）中，取新鲜植物材料在液氮环境下充分研磨成细粉状，快速转移到含有细胞裂解液的离心管中，震荡10秒后室温放置5分钟；步骤（2）中，向步骤（1）中的离心管中加1/3细胞裂解液体积的蛋白质-DNA沉淀溶液，上下颠倒混匀， 4℃放置10分钟，离心10分钟；步骤（3）中，转移上清液到新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒离心管混匀，室温放置10分钟后，离心10分钟；步骤（4）中，弃上清液，用体积浓度为75%乙醇洗涤沉淀，室温空气干燥3分钟，加DEPC水稀释的DNA酶Ⅰ溶液，37℃水浴15分钟；步骤（5）中，加DEPC水和盐酸胍，上下颠倒混匀，离心5分钟；步骤（6）中，转上清液到新的离心管，加沉淀浓度为1.5-2.5mol/L的LiCl溶液，混匀，-20℃静置30分钟或4℃静置10小时；步骤（7）中，离心30分钟，用体积浓度75%乙醇洗涤，空气干燥3分钟，溶解在DEPC水中-80℃保存。

按上述方案，所述的室温为25℃左右的温度。

本发明的有益效果在于：1、操作步骤简单、方便、成本低廉、可用于微量操作。2、本总RNA提取方法中无需使用有机溶剂，就能去除材料中的蛋白质、DNA、多糖、多酚等有机类物质。3、也因为无需使用有机溶剂，防止了环境的污染，减小了对人体的危害。

附图说明

图1是本发明一个具体实施例的流程框图。

图2是根据实施例1步骤提取的总RNA的电泳结果图。

图3是根据实施例1步骤提取的总RNA的RT-PCR结果图。

图4是根据实施例1步骤提取的总RNA的OD值扫描结果图。

具体实施方式

下面结合附图进一步说明本发明的实施例。

溶液及试剂准备：

①    细胞裂解液