[发明专利]人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白制法及用途

权利要求书

1.一种人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白，含有Arg198Ile/His200Phe的突变，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白的第198位精氨酸突变为异亮氨酸，第200位的组氨酸突变为苯丙氨酸。

3.一种获得人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白的方法，通过以下步骤实现：

(1)将SEQ ID NO.2的DNA序列人工操作连入表达载体质粒pET-28a；

(2)用含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的DNA序列做为引物做聚合酶链式反应：反应缓冲液(buffer)10ul，dNTP 4ul，上游引物1ul，下游引物1ul，模板质粒1ul，聚合酶1ul，双蒸水补足到50ul。采用两步法做PCR，即98℃变性1min，98℃10sec，68℃6min30sec 30个循环后结束反应；DpnI内切酶消化PCR产物中的模板质粒，80℃20min后使酶失活；

(3)将表达载体转化入宿主细胞大肠杆菌BL21，在如下条件下培养：在1L LB液体培养基中接种入10ml的复苏的转入上述质粒的BL21菌液，37℃300rpm剧烈震荡2～3个小时，按终浓度为1mM的条件加入诱导剂IPTG，同样条件震荡诱导表达4～5个小时从而表达出人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白；

(4)利用AKTA purifier系统分离纯化出该人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述编码人胰岛素样生长因子结合蛋白7的DNA序列通过以下方法获得：

设计两条可以将野生型蛋白密码子突变成目的氨基酸密码子的引物，上游引物序列为SEQ ID NO.3，下游引物序列为SEQ ID NO.4，将上述合成的引物用双蒸水稀释到终浓度10uM将IGFBP7野生型蛋白表达载体pET-28a质粒稀少到10ng/ul，以上述引物和模板、采用具有高保真性质的PCR反应，反应条件为：反应缓冲液10ul，dNTP 4ul，上游引物1ul，下游引物1ul，模板质粒1ul，聚合酶1ul，双蒸水补足到50ul，采用两步法做PCR；DpnI内切酶消化PCR产物中的模板质粒，80℃20min失活内切酶后做转化：将消化后PCR产物加入200μl制备好的感受态大肠杆菌中，冰浴30分钟后42℃热激90秒后冰浴3分钟；加入800μl LB液体培养基，37℃，150转/分钟摇菌1个小时后低速离心除去700ul上清，剩余300ul菌液均匀涂布于卡纳霉素阳性的LB琼脂培养板上，倒置平板，37℃培养箱内12-16h，每个转化平板分别挑取5个克隆进行测序，以验证密码子的定向突变是否成功。

5.根据权利要求1所述的一种人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。