[发明专利]人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白制法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，涉及一种胰岛素生长因子结合蛋白7(IGFBP7)的突变体蛋白制法及其用途。

背景技术

胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBPs)是一类与胰岛素样生长因子(IGF)具有高亲和力的分泌蛋白包括IGFBP1-15。其在体内可以通过可逆的结合来调节IGF的生物利用度，从而调节胚胎发育，细胞增殖等过程。近几年的研究发现该蛋白家族除了参与调节IGF的作用之外，还具有独立于IGF分子网络(IGF-independent)的作用。其中胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7，IGFBP7)基因是我们实验室通过抑制性差减杂交法(suppression subtractive hybridization，SSH)从结肠腺癌-正常粘膜的差减cDNA文库中筛出，并在结肠腺癌中差异表达的一个基因，随后一直致力于该基因在结直肠癌中作用的研究，通过IGFBP7对结直肠癌细胞的生物学效应的探索以及分析结直肠癌病人癌组织的IGFBP7蛋白表达情况和病人预后的相关性分析，发现IGFBP7在结直肠癌中可能是一个侯选抑癌基因，另外在进行IGFBP7在结直肠癌中作用研究的同时，意外地发现结直肠癌病人空腹血糖与结直肠癌组织IGFBP7的表达水平呈正相关。国外也有报道发现未经治疗的2型糖尿病患者有明显的外周血血清IGFBP7聚集现象，提示该基因与2型糖尿病间存在相关性，鉴于以上研究，可推测IGFBP7是一个与结直肠癌、糖尿病都相关的重要基因。与IGFBP1-6相比，IGFBP7和IGFI的结合能力要弱5倍，但和胰岛素结合能力要强500倍，胰岛素因为其在结直肠癌以及糖尿病的发生发展中发挥着重要作用，预示着进行IGFBP7与胰岛素的结合相关方面的研究将有极为重要的意义。目前还没有相关IGFBP7与胰岛素结合的关键氨基酸位点的文献报道。因此研究清楚IGBFP7与胰岛素结合位点可以为将来设计药物干预胰岛素抵抗奠定理论上的基础。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种可以表达人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白，该蛋白含有Arg198Ile/His200Phe的突变。所述的一种可以表达人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列，该蛋白是切除了IGFBP7氨基末端26个氨基酸信号肽的蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种获得人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白的方法，通过以下步骤实现：

(1)将编码人胰岛素样生长因子结合蛋白7的DNA序列(SEQ ID NO.2)人工操作连入表达载体质粒pET-28a；

(2)用含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的DNA序列做为引物做聚合酶链式反应：反应缓冲液(buffer)10ul，dNTP 4ul，上游引物1ul，下游引物1ul，模板质粒1ul，聚合酶1ul，双蒸水补足到50ul。采用两步法做PCR，即98℃变性1min，98℃10sec，68℃6min30sec 30个循环后结束反应；DpnI内切酶消化PCR产物中的模板质粒，80℃20min后使酶失活；

(3)将表达载体转化入宿主细胞大肠杆菌BL21(Edege Bio System)，在如下条件下培养：在1L LB液体培养基中接种入10ml的复苏的转入上述质粒的BL21菌液，37℃300rpm剧烈震荡2～3个小时，按终浓度为1mM的条件加入诱导剂IPTG，同样条件震荡诱导表达4～5个小时从而表达出人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白；

(4)利用AKTApurifier系统分离纯化出该人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋白。

本发明中Arg198Ile/His200Phe指相对于野生天然性人胰岛素样生长因子结合蛋白7而言，其第198位精氨酸(Arg)突变为异亮氨酸(Ile)，第200位的组氨酸(His)突变为苯丙氨酸(Phe)。

本发明目的是从人结直肠癌细胞系SW480cDNA文库中选出igfbp7基因编码序列，然后构建到原核表达载体pET28a质粒中，使其能够在大肠杆菌菌株BL21中表达IGFBP7蛋白。在该表达载体的基础之上，构建人胰岛素样生长因子结合蛋白7突变蛋，转化BL21后表达纯化突变蛋白，指出IGFBP7与胰岛素结合的关键位点。