[发明专利]塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法

权利要求书

1.一种塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征在于，具体步骤如下：

①分别在塔式蚯蚓生态滤池不同填料层取多种填料进行预处理；

②利用DNA提取试剂盒提取基因组总DNA；

③利用16S rDNAV3区引物对样品DNA进行巢式PCR扩增；

④利用变性梯度凝胶电泳即DGGE技术分析PCR扩增产物，得到的DGGE图谱利用Quantity one软件分析；

⑤特征DGGE条带切割回收，样品DNA再次PCR后测序分析，判定微生物种类。

2.根据权利要求1所述塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征为步骤①中所述多种填料预处理，包括塔式一级蚯蚓生态滤池、塔式二级蚯蚓生态滤池和塔式三级蚯蚓生态滤池中的土壤、砂石和碎青石填料。填料先经过-80℃的冷冻干燥然后研磨、最后100目过塞。

3.根据权利要求1所述塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征为步骤②中所述的DNA提取试剂盒，具体为MOBIO公司的Ultra Clean Soil DNA isolation KIT试剂盒，包括Bead SolutionTubes、2ml Collection Tubes、Spin Filter Units in 2ml Tubes、IRS solution、Solution S1、Solution S2、SolutionS3、Solution S4、Solution S5。

4.根据权利要求1所述塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征为步骤③中所述的16S rDNAV3区引物，设计的引物为63F和1387R(一次PCR)；338F-GC和518R(二次PCR)。一次PCR扩增条件为预变性94℃5min，然后94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸45s共30个循环，最后在72℃下延伸10min。二次PCR扩增条件为预变性95℃10min，然后95℃变性1min，63℃退火2min，72℃延伸1min共30个循环，最后在72℃下延伸10min。

5.根据权利要求1所述塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征为步骤④中利用DGGE分析所述PCR扩增产物的条件为：制备变性剂尿素浓度梯度50％-75％，丙烯酰胺凝胶浓度为10％的变性梯度凝胶电泳(DGGE)，电泳电压90V，电泳时间12h，二溴乙锭染色15min，脱色25min。

6.根据权利要求1所述塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征为步骤⑤中特征条带回收DNA再次PCR，PCR引物为338F和518R，扩增条件：预变性94℃10min，然后94℃变性1min，62℃退火2min，72℃延伸1min共30个循环，最后在72℃下延伸10min。