[发明专利]塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及到利用DNA提取试剂盒和PCR-DGGE技术，对塔式蚯蚓生态滤池中的多级复合填料(土壤、砂石、碎青石)中的微生物群落组成进行分析检测，属于环境微生物分子生态学领域。

背景技术

塔式蚯蚓生态滤池是一种根据蚯蚓具有提高土壤透水性能和促进有机物质分解转化的生态学功能而设计的一种生物、生态相结合技术，因为脱氮除磷能力强、运行费用低、无污泥产生等优点，在农村生活污水处理领域应用广泛。为了提高废水处理性能和稳定性，人们对塔式蚯蚓生态滤池的运行条件和污染物去除机理进行了大量研究。废水处理过程中主要是依赖土壤、砂石和碎青石中的微生物群落来降解和转化污染物，但由于研究技术和手段的缺乏，人们对塔式蚯蚓生态滤池中微生物群落研究甚少，只好通过控制和监控塔式蚯蚓生态滤池的物化参数来实现废水的无害化排放。但这些物化条件的改变是否破坏微生物群落结构，能否长期稳定的达到废水的高效处理，都是工程师们和微生物学家热衷的问题。因此需要对参与废水处理的微生物群落中各个种群的组成、丰度、分布及其在环境中生理生化特性进行全面研究，确定出塔式一级蚯蚓生态滤池、塔式二级蚯蚓生态滤池和塔式三级蚯蚓生态滤池在废水处理过程中的优势微生物种群。以此为基础改变操作条件，以适应废水生物处理中涉及的微生物的生长，优化塔式蚯蚓生态滤池废水处理效率。

目前自然界中只有很少部分微生物能够被分离和纯化，因此传统的微生物培养和鉴定方法不足以代表微环境中的真实情况。rRNA基因同源分析方法是目前分子生物学研究的热点，是多种分子生物学技术的组合，它通过对微生物的rRNA进行分析，揭示微生物的多样性，是分子微生物生态学的重要方法，目前取得了大量的成果。同源性分析方法中包括环境样品的总DNA提取，探针及引物的设计，PCR扩增，梯度电泳(DGGE&TGGE)，基因文库的筛选，序列测定及分析，系统树的构建，原位杂交等技术。rRNA基因分析方法是微生物多样性及微生物生态学研究方法的重大革新，使人们对微生物群体有全面的，进一步的认识。

变性梯度电泳DGGE(denaturing gradient gelelect rophoresis)可分离长度相同但是序列不同的DNA片断的混合物，对于特异性引物PCR扩增的环境微生物的16SrDNA基因，一般的电泳很难将序列不同的片断分开，DGGE胶在聚丙烯酰胺胶中添加了线性梯度的变性剂，可以形成从低到高的线性梯度，在一定的温度下，同一浓度的变性剂中，不同序列的产物，其部分解链程度不同，DNA解链程度不同决定其电泳的迁移率，结果不同的产物在凝胶上分离开。在变性条件适当的情况下，该技术能分辨一个碱基对，DGGE在微生物群落结构的研究，微生物种群的动态分析，富集培养物以及分离物的分析，16SrDNA同源性的分析中得到广泛应用。

目前有利用DGGE技术分析污水厂污泥和工业废水处理中的微生物群落的专利申请，但是用来处理农村生活污水的塔式蚯蚓生态滤池填料复杂，微生物种类繁多，所以这方面的研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落组成的检测技术，即填料中DNA的提取，总DNA的PCR再经DGGE分离DNA条带，分离的DNA再次PCR后测序进而对塔式蚯蚓生态中多种填料如土壤、砂石和碎青石中微生物群落组成进行检测的技术。

本发明技术方案是：

①塔式蚯蚓生态滤池不同填料层取多种填料进行预处理，利用DNA提取试剂盒提取基因组总DNA；

②设计16S rDNAV3区引物[63F和1387R(一次PCR)；338F-GC和518R(二次PCR)]对样品DNA进行巢式PCR扩增；

③利用变性梯度凝胶电泳即DGGE技术分析PCR扩增产物，得到的DGGE图谱利用Quantity one软件分析；

④特征DGGE条带切割回收，样品DNA再次PCR后测序分析，判定微生物种类；

步骤①中，样品的预处理：取塔式蚯蚓生态滤池少量的土壤、砂石和碎青石放入无菌带，放入冷冻干燥仪冷冻干燥后用研钵研磨，最后过100目的塞子，无菌带分装放入-20℃中冷藏备用。