[发明专利]用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法，属化学中包含酶或微生物的测定或检验方法。

背景技术

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）在自然界中分布广泛，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，可致各类动物感染，而人在感染嗜水气单胞菌时会发生食物中毒、腹泻等症状，并且是免疫抑制患者和肝功能疾病患者的机会致病菌，是一种典型的人、兽、鱼共患病病原菌。嗜水气单胞菌除了对水产养殖业带来巨大经济损失外，其对公共卫生，尤其是在临床疾病和食品安全方面的影响也非常严重。

传统的嗜水气单胞菌的检测方法是生理生化鉴定和免疫学诊断，但由于该菌的许多生化特征不稳定，血清型也较复杂，故易产生误判。因此已有多项嗜水气单胞菌的PCR检测方法方面的报道，如中国发明专利申请“水产动物及人类病原菌——嗜水气单胞菌基因诊断试剂盒及检测方法（公开号CN1560275）”、中国发明专利申请“水生实验动物剑尾鱼病原菌—嗜水气单胞菌PCR检测试剂盒及检测方法（公开号CN1978665）”、中国发明专利申请“嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒及其检测方法（公开号CN1506468）”、中国发明专利申请“一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测试剂盒和检测方法（公开号CN 101736073A）”和中国发明专利申请“致病性嗜水气单胞菌检测用试剂及其检测方法（公开号CN101418335）”等，但上述所有关于嗜水气单胞菌的PCR检测方法都是普通的PCR检测，而且都为定性测定而不能定量测定。

又有采用PQ- PCR检测嗜水气单胞菌方法的相关报道，如“嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR检测方法的建立”（王海波等,《中华预防医学杂志》，43（7），611－614）所公开的。针对细菌的种特异性基因采用 PCR 技术进行快速检测是近年来病原菌检测的热点，与常规PCR相比，实时荧光定量PCR检测技术具有特异性更强、敏感度更高、操作简便快捷、可定性定量、且可有效解决常规PCR污染问题等优点。但该公开技术中的引物设计的对象为嗜水气单胞菌的气溶素基因（aerolysin）和粘附素基因（adhesins）。

大量研究表明，嗜水气单胞菌有致病菌株和非致病菌株之分，尽管嗜水气单胞菌及其胞外产物具有多种毒力因子，包括：粘附素（adhesins）、侵袭素（invasions）、肠毒素（enterotoxins）、溶血素（hlyA）、气溶素（aerolysin）、外膜蛋白（outermembrane proteins）、丝氨酸蛋白酶基因（ahpA）等，这些毒力因子在细菌的致病过程中起重要作用，不过这些毒力因子在对机体致病作用的发挥上是相互协同的，有些毒力因子的存在并不一定会致病而需要多种毒力因子的协同才会致病，而有些毒力因子只要存在便肯定是致病的。其中溶血素基因（hlyA）和丝氨酸蛋白酶基因（ahpA）就是只有致病的嗜水气单胞菌菌株所具备的，即嗜水气单胞菌无毒力菌株一般没有溶血素基因（hlyA）和丝氨酸蛋白酶基因（ahpA），因此测定溶血素基因（hlyA）和丝氨酸蛋白酶基因（ahpA）对辨别有毒力的嗜水气单胞菌从而在应急预警和突发疾病处理方面具有更大的应用价值。

发明内容

针对上述不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种针对仅存于有毒力菌株的DNA的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法。

本发明提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法之一，先制备嗜水气单胞菌模板DNA，再进行扩增反应，即将准备好的扩增反应液加入模板DNA中，然后在PCR仪上进行扩增反应并获得数据供计算机进行计算，最后判断结果，所说扩增反应液中包括针对仅存于有毒力的嗜水气单胞菌菌株中的因子的上、下游引物，其中上游引物的DNA序列为5’-ACC GCA AGA TCA ACG ATA CCG AGT-3’，下游引物的DNA序列为5’-ATC CAG CGA GAT CCG CAC TAT CTT-3’。

所说扩增反应液中还包括TaqMan探针，该TaqMan探针的DNA序列为5’-（FAM）-AAC ATC TCG CTG GTT TAC CGG GTC AA-（TAMRA）-3’。