[发明专利]一种产L-精氨酸的菌株和利用该菌株生产L-精氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用黄色短杆菌生产L-精氨酸的方法，涉及以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) ATCC14067为出发菌株，采用亚硝基胍逐级诱变，筛选切断竞争性代谢途径具有组氨酸、丁二酸营养缺陷型菌株的突变株，并筛选具有精氨酸结构类似物、半胱氨酸结构类似物抗性的突变株HX1009（His^-，Suc^-，D-Arg^r，SMC^r），以提高L-精氨酸的产量。属于生物工程技术领域。

背景技术

L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，是合成蛋白质和肌酸的原料，也是生物体尿素循环的重要中间代谢物，具有增加人类生长激素、恢复疲劳、增强肌肉力量及提高免疫力、防治心血管疾病以及增强男性精子活性等作用，在医药、食品领域上具有广泛的用途。

L-精氨酸的生产方法有水解法和发酵法，水解法是以含有丰富L-精氨酸的猪毛、蹄甲、血粉、明胶、鱼精蛋白、小杂鱼（如马面鱼皮、鱼骨）等为原料，经水解、分离、制备得到L-精氨酸，如中国专利CN1161959A，96100529.7，200910019665.6等公布的方法。但是，该提取法存在操作费时、收率低，环境污染大、不能满足大规模生产等问题。

发酵法是采用大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、黏质沙雷菌、棒杆菌或短杆菌等微生物，通过传统诱变或基因工程的方法，筛选解除精氨酸的生物合成的反馈抑制和反馈阻遏突变株，或切断竞争性代谢途径营养缺陷型菌株和切断进一步的代谢途径突变株，以提高L-精氨酸的产量。如日本专利JP60083593公布了培养2-噻唑基丙氨酸抗性株生产L-精氨酸的方法；美国专利US5034319公布了培养半胱氨酸或其类似物抗性菌生产L-精氨酸的方法；龚建华等选育组氨酸缺陷型和具有磺胺胍的抗性的钝齿棒状杆菌产L-精氨酸最高达34g/L（微生物学报，1991,31(6): 460-465.）；黄继红等选育磺胺胍抗性的谷氨酸高产菌种LH，摇瓶96h产酸38 g/L（氨基酸和生物资源2005,27(3): 46-48）等，这些通过诱变及结构类似物抗性的方法往往比较单一，筛选得得的突变株往往产酸不高，水平3%左右，甚至遗传稳定性较差。

对于L-精氨酸基因工程菌的研究有很多报道，例如日本味之素株式会社CN1258736A公开通过提高编码精氨琥珀酸合成酶的基因拷贝数增强细胞内的精氨琥珀酸合成酶的活性提高棒状细菌L-精氨酸生产能力，以及CN1347982A通过破裂编码细菌中参与L-精氨酸生物合成的精氨酸阻遏物的基因，使该阻遏物的基因缺失，从而来提高该细菌具有L-精氨酸生产能力；CJ第一制糖株式会社CN101517066A公开了通过乙酰鸟氨酸基转移酶的推定基因argD2基因的高表达的棒杆菌属的突变菌株CJR0500，提高用谷氨酸棒杆菌生产L-精氨酸的方法。但是这些工程菌往往对单一基因进行改造，表达的水平都很低，产酸水平还不高，还不足以应用于实际生产。