[发明专利]猪体细胞转基因克隆质粒pEGFP-N1-shRNA及其构建方法

权利要求书

1.一种用于猪体细胞转基因克隆的pEGFP-N1-shRNA质粒，其特征在于它是通过将核苷酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的靶向PRRSV基因shRNA表达盒插入载体pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点所得。

2.根据权利要求1所述的用于猪体细胞转基因克隆的pEGFP-N1-shRNA质粒，其特征在于该质粒通过如下步骤获得：

(1)向已有的靶向PRRSV基因的pSUPER-shRNA表达质粒中引入EcoO109I酶切位点：

a.设计上游引物SEQ ID NO.1，下游引物SEQ ID NO.2，以靶向PRRSV基因的pSUPER-shRNA表达质粒为模板PCR扩增所述的pSUPER-shRNA表达质粒中大小为363bp的片段，将该片段连接入T载体获得重组T载体；

b.利用NaeI和SacII对所述的重组T载体双酶切鉴定，胶回收334bp的小片段，利用NaeI和SacII对所述的靶向PRRSV基因的pSUPER-shRNA表达质粒双酶切，胶回收2843bp线性大片段，连接所述的两片段，得到改造后靶向PRRSV基因的shRNA表达质粒pSUPER-E-shRNA；

(2)靶向PRRSV基因的shRNA表达盒连入载体pEGFP-N1：

a.利用EcoO109I对所述的改造后质粒pSUPER-E-shRNA进行双酶切鉴定并胶回收350bp的靶向PRRSV基因shRNA表达盒；

b.利用EcoO109I对载体pEGFP-N1的进行酶切，回收4733bp的线性化pEGFP-N1载体；

c.线性化的pEGFP-N1载体的去磷酸化；

d.将所述的靶向PRRSV基因shRNA表达盒连入所述的去磷酸化的pEGFP-N1线性化载体，得到所述的用于猪体细胞转基因克隆的pEGFP-N1-shRNA质粒。

3.根据权利要求2所述的用于猪体细胞转基因克隆的pEGFP-N1-shRNA质粒，其特征在于所述的靶向PRRSV基因的pSUPER-shRNA表达质粒为质粒pSUPER-P2、pSUPER-G1、pSUPER-mG1。

4.根据权利要求2所述的用于猪体细胞转基因克隆的pEGFP-N1-shRNA质粒，其特征在于所述的质粒pSUPER-P2是将序列为SEQ ID NO.3所示靶向PRRSV基因shRNA模板序列插入pSUPER质粒的BglII和XhoI酶切位点之间所得；所述的质粒pSUPER-G1是将序列为SEQ IDNO.4所示靶向PRRSV基因shRNA模板序列插入pSUPER质粒的BglII和XhoI酶切位点之间所得；所述的质粒pSUPER-mG1是将序列为SEQ ID NO.5所示靶向PRRSV基因shRNA模板序列插入pSUPER质粒的BglII和XhoI酶切位点之间所得。