[发明专利]猪体细胞转基因克隆质粒pEGFP-N1-shRNA及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于胚胎生物技术领域，涉及猪体细胞转基因克隆质粒pEGFP-N1-shRNA及其构建方法，所获转基因质粒可在细胞、胚胎或动物整体水平有针对性地用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抑制研究，为克隆生产转基因抗病新品种奠定基础。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)又称“蓝耳病”，以母猪的繁殖障碍和新生仔猪的呼吸道症状为特征，是目前危害世界养猪业的重大疫病之一，在全世界均受到高度关注。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有高度变异性，感染猪体后会降低机体先天性免疫应答，病毒能在猪体持续性存在并易继发其他病原的混合感染，增加了临床诊疗的难度。

一些针对基因特定序列的小干扰RNA片段和目标基因结合后能够高效特异地促进目标基因的mRNA降解，阻断相应基因的表达，可在细胞内发挥基因沉默的作用，这一现象称为RNA干扰(RNAi)，RNAi技术在某些疾病的诊断、治疗和预防方面具有重要作用。RNAi现象在生物中普遍存在。RNAi是一种强大的基因沉默技术，是细胞内监控寄生的遗传物质、消除无用的信息模板和调节基因时空表达的一种分子机制。它与体液和细胞免疫一起形成了高级生物体内免疫系统的三大支柱。同时，RNAi在抵御病毒感染、维持基因组转座子的稳定以及某些物种生殖细胞的发育过程中都起着重要作用。小干扰RNA调控潜能的发现为研究病毒与宿主之间的相互作用提供了新的视角，对感染细胞凋亡的抑制是病毒保证自身生存的常用机制。目前，RNAi技术已被广泛用于人类乙肝、HIV、丙肝病毒、脊髓灰质炎病毒和流感病毒预防和治疗方面的研究。研究表明，RNAi技术通过对病毒复制和转录的高效特异的抑制作用，在抗病毒领域有着广阔的应用前景。

现有的研究资料证实，RNAi技术不仅可以在整体水平上实现瞬时RNAi效应，而且可以在转基因动物体内实现长期、稳定的RNAi效应。基于四环素等诱导的条件型RNAi转基因策略的出现，可在特定的时间和组织发挥RNAi作用，转RNAi基因动物的生产已成为相关领域研究的热点之一。Masaru Okabe实验室首次成功生产应用RNAi技术的转基因小鼠，这种转基因小鼠体内能产生特异性针对GFP的siRNA，可以在GFP转基因小鼠全身各个组织内敲低(knock-down)GFP表达，对GFP表达的抑制程度最高可达96％；与此同时，该实验室也生产出应用RNAi技术的转基因大鼠。Golding等(2006)用表达针对疯牛病朊蛋白的shRNA慢病毒转染山羊胎儿成纤维细胞，经过细胞核移植获得1只转RNAi基因克隆山羊胎儿(妊娠81d手术取出)，开创了转RNAi基因大动物模型研究的先河。Golding等同时证实，通过将重组shRNA慢病毒注射入牛卵子的卵周隙，经体外受精及培养，40％卵子发育至囊胚，76％的囊胚表达shRNA(绿色荧光蛋白作为报告基因)。目前，RNAi技术与转基因克隆相结合生产转基因猪也取得重要进展。Dieckhoff等(2008)通过慢病毒转染猪成纤维细胞，通过体细胞核移植获得了敲低猪内源性逆转录病毒的转基因克隆猪；Ramsoondar等(2009)也通过细胞核移植获得表达猪内源性逆转录病毒小干扰RNA的转基因克隆猪。

本发明基于发明人前期的工作，应用信息网络技术设计靶向PRRSV基因ORF1、ORF5和ORF7的12个小RNAi分子，利用shRNA表达质粒，在Marc-145细胞探明了靶向ORF1、ORF5和ORF7不同区域均存在RNAi基序，并能有效地抑制靶基因mRNA的转录、蛋白质合成和病毒复制；再进一步构建表达shRNA的重组腺病毒，探明其在Marc-145和猪肺泡巨噬细胞上也可以明显抑制靶基因mRNA的转录、蛋白质合成和病毒PRRSV复制；最后筛选出1株重组病毒rAd-P2，可以有效抑制SY0608株高致病性PRRSV的复制，猪体外试验证明rAd-P2对高致病性PRRSV有明显抑制作用，并可以推迟PRRSV感染发病、减轻其发病症状和病理损伤。但已有的质粒载体属于瞬时转染载体，在真核细胞中无报告基因和筛选基因，不利于转基因克隆操作时对核供体细胞的选用；而且腺病毒载体只整合到胞浆中而不能整合到基因组中，在反复的细胞分裂情况下存在基因表达不够持久稳定等缺点，这些都不利于外源基因的整合与表达，也不利于抗PRRSV shRNA表达盒通过体细胞核移植实现重组与表达。