[发明专利]罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备及检测方法

权利要求书

1.罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的制备方法，包括如下步骤：

  1）制备免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-HS－BSA，其分子结构式为：

经红外光谱和紫外光谱确定其结合比比在25.9~61.7之间；

2）动物免疫：实验动物选用雌性BALB/c 小鼠，实验免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-HS－BSA的剂量为100μg/只，用PH7.2 PBS溶液稀释抗原，首次免疫加等量弗氏佐剂，制成乳化剂，腹腔注射，2周后追加免疫加等量弗氏不完全佐剂，制成乳化剂，腹腔注射，以后每隔2周腹腔注射上述浓度为200μg/ml的人工抗原0.5ml，共加强免疫3次；

3）抗血清的制备：末次免疫后3天摘除眼球采血，3000rpm离心5分钟，收集血清-20℃保存即成。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述罗汉果苷V-HS-BSA，采用如下方法制成：

1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；

2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；

3） 取步骤2）的反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应；

4）搅拌下滴加BSA-碳酸缓冲液，加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；

5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得偶联产物为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原，置于-20℃下保存。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述的BSA-碳酸缓冲液为10mgBSA溶于1mlNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。

4.用权利要求1所述制备方法制备的罗汉果甜苷V的特异性抗体血清。

5.一种罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的检测方法，包括如下步骤：

1）制备包被用的人工抗原罗汉果甜苷V-HS－HSA，其分子结构式为：

经红外光谱和紫外光谱确定其结合比在38.1~90.3之间；

2）采用间接酶联免疫吸附分析法，按方阵法确定抗血清的最适工作浓度、效价；

将罗汉果甜苷V-HS-HSA用碳酸缓冲液稀释为1μg/ml，每孔加100ml,4℃过夜，用PBST溶液洗涤三次，每次3min，每孔加5%脱脂牛奶封闭液300μl,37℃温箱lh，洗涤同上，将阳性血清作不同浓度的稀释后顺序加入，每孔100μl ，每块板同时设空白对照，阴性对照，37 ℃ 温箱1h，洗涤同上，用PBST溶液将HRP标记羊抗鼠IgG稀释到1︰1000倍，每孔加入100μl,37 ℃ 温箱1h，洗涤同上，每孔加新鲜配制的ABTS底物显色剂100 μl,37℃温箱25min,测定OD 值；

3）检测罗汉果甜苷V对抗体的抑制反应：用罗汉果甜苷V的标准品溶液系列稀释罗汉果甜苷V抗血清，用竞争ELISA法 测OD 值，并与同稀释度的抗血清的OD 值比较；

4）以罗汉果甜苷V-HS-HSA作包被原进行筛选：分别以罗汉果甜苷V-HS－HSA、BSA 、HSA 包被酶联反应板，在同一稀释度下，观察血清对罗汉果甜苷V-HS－HSA、BSA、HAS的反应。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是：所述罗汉果甜苷V-HS-HSA，采用如下方法制成：

1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；

2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；

3） 取步骤2）的反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应10min；

4）搅拌下滴加HSA-碳酸缓冲液，加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；

5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原，置于-20℃下保存。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征是：所述的HSA-碳酸缓冲液为10mgHSA溶于1mlNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。