[发明专利]罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及小分子化合物免疫化学和免疫分析技术，具体是一种罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备及检测方法。

背景技术

利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的特性，定量地检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。目标分析物分子免疫学特性以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性是该领域极为重要的研究内容。我国是中药饮片和中药提取物使用大国，传统的药物分析方法主要是依靠气相色谱（GC )、液相色谱（HPLC ）或质谱等物化分析手段，定性定量分析中药材和中药提取物有效成分的含量。由于传统的理化分析方法通常繁琐复杂，样品前处理过程复杂、工作量大、仪器昂贵、要求有熟练的技术人员及较长的分析周期，因此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及价廉的检测技术能在实验室内和野外进行大批量的检测。免疫分析法正具备这些优点，将开创药物分析的新纪元。

发明内容

本发明的目的是公开一种罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备方法，该方法工艺简单，成本低；

本发明的另一个目的是要为罗汉果甜苷V特异性抗血清提供一种快捷、准确的检测方法。

本发明所述罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的制备方法，包括如下步骤：

1）制备免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯－牛血清蛋白复合物（简写为罗汉果甜苷V-HS-BSA），其分子结构式为：

经红外光谱和紫外光谱确定其结合比在25.9~61.7之间；

2）动物免疫：实验动物选用雌性BALB/c 小鼠，实验免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-HS－BSA的剂量为100μg/只，用PH7.2 PBS溶液稀释抗原，首次免疫加等量弗氏佐剂，制成乳化剂，腹腔注射，2周后追加免疫加等量弗氏不完全佐剂，制成乳化剂，腹腔注射，以后每隔2周腹腔注射上述浓度为200μg/ml的人工抗原0.5ml，共加强免疫3次；

3）抗血清的制备：末次免疫后3天摘除眼球采血，3000rpm离心5分钟，收集血清-20℃保存即成。

所述罗汉果苷V-HS-BSA，采用如下方法制成：

1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；

2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；

3） 取步骤2）的反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应；

4）搅拌下滴加BSA-碳酸缓冲液（10mgBSA溶于1mlNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液），加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；

5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得偶联产物为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原，置于-20℃下保存。

一种罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的检测方法，包括如下步骤：

1）制备包被用的人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯－人血清蛋白复合物（简写为罗汉果甜苷V-HS-HSA），其分子结构式为：

经红外光谱和紫外光谱确定其结合比在38.1~90.3之间；

2）采用间接酶联免疫吸附分析法，按方阵法确定抗血清的最适工作浓度、效价；

将罗汉果甜苷V-HS-HSA用碳酸缓冲液稀释为1μg/ml，每孔加100ml,4℃过夜，用PBST溶液洗涤三次，每次3min，每孔加5%脱脂牛奶封闭液300μl,37℃温箱lh，洗涤同上，将阳性血清作不同浓度的稀释后顺序加入，每孔100μl ，每块板同时设空白对照，阴性对照，37 ℃ 温箱1h，洗涤同上，用PBST溶液将HRP标记羊抗鼠IgG稀释到1︰1000倍，每孔加入100μl,37 ℃ 温箱1h，洗涤同上，每孔加新鲜配制的ABTS底物显色剂100 μl,37℃温箱25min,测定OD 值；

3）检测罗汉果甜苷V对抗体的抑制反应：用罗汉果甜苷V的标准品溶液系列稀释罗汉果甜苷V抗血清，用竞争ELISA法 测OD 值，并与同稀释度的抗血清的OD 值比较；

4）以罗汉果甜苷V-HS-HSA作包被原进行筛选：分别以罗汉果甜苷V-HS－HSA、BSA 、HSA 包被酶联反应板，在同一稀释度下，观察血清对罗汉果甜苷V-HS－HSA、BSA、HAS的反应。

所述罗汉果甜苷V-HS-HSA，采用如下方法制成：