[发明专利]一种产芽孢培养基及其优化过程与应用

权利要求书

1.一种产芽孢培养基，其特征在于，其组成及重量配比为，玉米粉0.5～3%，麸皮0.1～1%，黄豆饼粉0.1～0.5%，十二水磷酸二氢钾0.01～0.1%，无水碳酸钙0.05～0.3%，余量为水。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基中可添加葡萄糖和/或糖蜜，其终重量为培养基总重量的0.5～1.5%。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，其组成及重量配比为，葡萄糖0.5～1.0%，玉米粉1.5～2%，麸皮0.3～0.5%，黄豆饼粉0.1～0.2%，十二水磷酸二氢钾0.03～0.07%，无水碳酸钙0.06～0.09%，余量为水，体系的pH= 6.5。

4.一种权利要求１所述培养基的优化方法，其特征在于：

    首先从接种菌体的状态、接种量、培养温度、溶氧量、发酵液起始pH、添加二价金属离子、培养时间等因素中利用单因子多水平试验筛选到决定产生芽孢关键因素是接种菌体的状态，并且确定了最优的接种量和培养时间；其次根据2次的Plackett-Burman Design，筛选出培养基成分中影响芽孢率和芽孢总数的三个主要因素：玉米粉、麸皮、CaCO₃；最后经最陡爬坡试验确定响应面法中心水平后采用响应曲面法（Response surface methodology，RSM）优化玉米粉、麸皮、CaCO₃的最适培养浓度。

5.一种权利要求1所述的培养基的应用，其特征在于：利用权利要求1所述的海洋芽孢杆菌的培养基对海洋芽孢杆菌进行培养，具体步骤为，

（1）首先活化保藏的海洋芽孢杆菌菌株，挑取活化后的单菌落接种于试管或克氏瓶上进行斜面培养，28℃下培养48h～96h，然后无菌取样、显微镜检测其培养物熟化程度，选择中央芽孢形成均一、两端着色清晰的斜面培养物作为发酵种子；

（2）将步骤（1）选择的芽孢形成均一，两端着色清晰的斜面培养物无菌接种于权利要求1所述的培养基中，36℃下培养12～18h至菌体达到对数生长期且菌体数量不低于10⁷CFU/mL，即可得到发酵种子液；

（3）将步骤（2）得到的发酵种子液按照8～10%的体积比例再次接种到权利要求1所述的培养基中，在生产罐中进行发酵培养，培养条件为，罐压0.05～0.06Mpa，风量100:10～100:150vvm，转速220～250rpm，培养温度为35℃～37℃；当发酵液芽孢率达到80～99%，有效芽孢数达10⁹CFU/mL～10¹⁰CFU/mL时，即可终止发酵，得到的是培养后的海洋芽孢杆菌。

6. 按照权利要求5所述的培养基的应用，其特征还在于：

步骤（2）中所述接种过程的接种比例为钩取一接种环的培养物接种于250mL～500mL培养液；1个18mm*180mm试管斜面培养物可接种于5L～10L发酵罐；并可按此比例放大到70L。