[发明专利]一种产芽孢培养基及其优化过程与应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，更具体地，是涉及响应曲面法优化的海洋芽孢杆菌高产活性芽孢的培养基及其应用，特别是指一种用于不易产芽孢的海洋地衣芽孢杆菌生产高活性芽孢的培养基及其应用。

背景技术

真菌病害给农、林业带来了巨大的损失，目前作物病害防治主要依靠使用广谱化学农药。然而大量使用化学农药导致病虫害的抗药性不断增加，农畜产品农药残留高、污染严重，食物和水源环境受到严重污染，人类健康和生态环境受到严重威胁。因此，逐步减少化学农药的使用，加快开发有自主知识产权的新型的、高效低毒的微生物农药新产品，十分必要和迫切，是关系到我国国民的健康、经济发展、保护环境和发展绿色农业的重大战略问题。

微生物源的生物农药是高效低毒农药的主要来源，也是世界生物农药开发的主要研究方向。然而随着陆地微生物的不断地开发，发现能产生新型抗生素的微生物资源已越来越少，加快开发丰富的海洋生物资源不仅成为世界科学家的共识，更成为世界大国竞争的焦点。为此我国也在“十一五”启动了海洋生物技术领域863计划，抢占海洋生物资源科技的战略制高点，加快利用海洋生物资源和生物技术开发出具有我国自主知识产权的创新产品。

尤其近年来，一方面我国设施蔬菜的蓬勃发展，许多真菌病害频繁发生，土传真菌病害逐年加重，另一方面又缺乏能有效防治真菌病害的生物农药。此外，常规农药的长期使用已出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地影响杀菌剂的防治效果。因此迫切需要能有效防治真菌病害的新型生物制剂。

从1998年起，中国科学院沈阳应用生态研究所胡江春等人，相继从辽宁黄渤海分离得到海洋地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)9912，从南海红树林木榄根际分离得到海洋芽孢杆菌(Bacillus subtilis)3728从南海柳珊瑚中分离到海洋枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)3512A等优良菌株，还证实了海洋芽孢杆菌9912、3728、3512能够产生很强抗菌活性物质，对大棚蔬菜土传病和真菌病害引起的连作障碍有很好的生物防治效果。其中海洋地衣芽孢杆菌9912，由中国科学院沈阳应用生态所和华北制药集团爱诺有限公司联合开发制品，田间试验表明对番茄灰霉病、黄瓜灰霉病、葡萄灰霉病、苹果轮纹病、梨黑星病、葡萄毛毡病和棉花黄萎病等作物病害生物防治效果突出，有望研制成新型的生物杀菌剂。然而海洋地衣芽孢杆菌9912在常规培养条件下不易产生芽孢，这严重阻碍了其研发成高效、无毒、低成本、易保存和运输、货架期长的活性芽孢制剂，因此本领域迫切需要筛选出产芽孢的培养限制因素，并进一步优化其发酵条件，提高产芽孢率和芽孢总数。

发明内容

本发明就是针对上述问题，提供了一种响应曲面法优化的海洋芽孢杆菌芽孢的培养基及其优化方法和应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：

响应曲面法优化的海洋芽孢杆菌芽孢的培养基，其组成及重量配比为，玉米粉0.5～3％，麸皮0.1～1％，黄豆饼粉0.1～0.5％，十二水磷酸二氢钾0.01～0.1％，无水碳酸钙0.05～0.3％，余量为水。

所述的培养基中可添加葡萄糖和/或糖蜜，其终重量为培养基总重量的0.5～1.5％。

其组成及重量配比为，葡萄糖0.5～1.0％，玉米粉1.5～2％，麸皮0.3～0.5％，黄豆饼粉0.1～0.2％，十二水磷酸二氢钾0.03～0.07％，无水碳酸钙0.06～0.09％，余量为水，体系的pH＝6.5。

优化过程：首先从接种菌体的状态、接种量、培养温度、溶氧量、发酵液起始pH、添加二价金属离子、培养时间等因素中利用单因子多水平试验筛选到决定产生芽孢关键因素是接种菌体的状态，并且确定了最优的接种量和培养时间。其次根据2次的Plackett-Burman Design，筛选出培养基成分中影响芽孢率和芽孢总数的三个主要因素：玉米粉、麸皮、CaCO₃；最后经最陡爬坡试验确定响应面法中心水平后采用响应曲面法(Response surface methodology，RSM)优化玉米粉、麸皮、CaCO₃的最适培养浓度。

利用所述的海洋芽孢杆菌的培养基对海洋芽孢杆菌进行培养的具体步骤为，

(1)首先活化保藏的海洋芽孢杆菌菌株，挑取活化后的单菌落接种于试管或克氏瓶上进行斜面培养，28℃下培养48h～96h，然后无菌取样、显微镜检测其培养物熟化程度，选择中央芽孢形成均一，两端着色清晰的斜面培养物作为发酵种子；