[发明专利]测定不对称二甲基精氨酸浓度的方法及诊断试剂盒

权利要求书

1.一种测定不对称二甲基精氨酸浓度的方法，其包括下述步骤：

1)向样品中加入二甲基精氨酸二甲氨基水解酶，使不对称二甲基精氨酸和水反应产生二甲胺和瓜氨酸，

2)向步骤1)的混合物中加入ATP、天冬氨酸和精氨琥珀酸合成酶，使瓜氨酸发生反应产生AMP，

3)向步骤2)的混合物中加入AMP脱氨酶，使AMP和水反应产生IMP和氨，

4)向步骤3)的混合物中加入ATP、NAD合成酶和脱氨基氧化型辅酶NAD，使氨发生反应生成氧化型辅酶，

5)通过测定产生的氧化型辅酶NAD的浓度测得不对称二甲基精氨酸的浓度，

可选地，上述二甲基精氨酸二甲氨基水解酶与ATP、天冬氨酸、精氨琥珀酸合成酶、AMP脱氨酶、NAD合成酶和脱氨基氧化型辅酶NAD分两批或三批加到样品中。

2.根据权利要求1所述的测定不对称二甲基精氨酸浓度的方法，其特征在于所述水来源于样品或额外加入，优选地，样品为血液或尿液。

3.根据权利要求1或2所述的测定不对称二甲基精氨酸浓度的方法，其特征在于测定产生的氧化型辅酶NAD的浓度时采用电化学、化学放光或脱氢酶偶联反应的方法进行，优选地，采用通过催化氧化型辅酶NAD为NADH的脱氢酶将氧化型辅酶NAD转化为NADH检测氧化型辅酶NAD的浓度，优选地，所述催化氧化型辅酶NAD为NADH的脱氢酶是葡萄糖脱氢酶或D-3羟丁酸脱氢酶。

4.根据权利要求1至3任一项所述的测定不对称二甲基精氨酸浓度的方法，其特征在于，当通过催化氧化型辅酶NAD为NADH的脱氢酶将氧化型辅酶NAD转化为NADH检测氧化型辅酶NAD的浓度时，还包括步骤6)加入黄递酶和四唑盐色原，通过检测生成的甲月替浓度测得氧化型辅酶NAD的浓度，优选地，四唑盐色原选自WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-8、WST-9、WST-10、WST-11、WST-20、WST-21、XTT、INT、TB、NTB、MOPMS或PMS。

5.根据权利要求1至4任一项所述的测定不对称二甲基精氨酸浓度的方法，其特征在于还包括去除样品中内源性瓜氨酸和氨干扰的步骤7)，该步骤在步骤1)之前进行，

步骤7)通过向样品中加入精氨琥珀酸合成酶和AMP脱氨酶使瓜氨酸转化为氨，

然后产生的氨及内源性的氨通过下述步骤8)或步骤9)去除，

步骤8)加入谷氨酸、ATP、PK、PEP和谷氨酰胺合成酶，使氨转化为谷氨酰胺和ADP，ADP和PEP在PK催化下生成ATP和丙酮酸，最后通过加入谷氨酰胺合成酶抑制剂终止反应，优选地，谷氨酰胺合成酶抑制剂为L-甲硫氨酸黄酰亚胺，或

步骤9)加入谷氨酸脱氢酶、2-酮戊二酸和NADPH，使氨转化为谷氨酸，最后通过加入谷氨酸脱氢酶抑制剂终止反应，优选地，谷氨酸脱氢酶抑制剂选自p-氯汞苯甲酸吡啶、4-4′-联吡啶二硫醚或2，2′-联吡啶二硫醚中的一种或者其组合。

6.一种不对称二甲基精氨酸浓度诊断试剂盒，其包含下述成分：

二甲基精氨酸二甲氨基水解酶    0.1-500kU/L，

ATP                           0.5-20mM，

天冬氨酸                      0.5-20mM，

精氨琥珀酸合成酶              0.1-500kU/L，

NAD合成酶                     0.1-500kU/L，

AMP脱氨酶                     0.1-500kU/L，和

脱氨基氧化型辅酶NAD           0.5-20mM，

所述试剂盒优选为三试剂试剂盒或二试剂试剂盒，其中二甲基精氨酸二甲氨基水解酶与其他成分位于不同的试剂中，优选地，精氨琥珀酸合成酶和AMP脱氨酶与其他成分也位于不同的试剂中，其中所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒，优选地，当所述试剂盒为液体试剂盒时还包括：

缓冲液        10-500mM，及

稳定剂        0.01-50％重量体积比，

优选地，所述缓冲液为Good′s缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或乙酸缓冲液，所述稳定剂为BSA、EDTA、表面活性剂、甘油或甘露醇。