[发明专利]测定不对称二甲基精氨酸浓度的方法及诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及测定不对称二甲基精氨酸浓度的方法及诊断试剂盒。特别地，本发明涉及利用二甲基精氨酸二甲氨基水解酶、ATP、天冬氨酸、精氨琥珀酸合成酶、AMP脱氨酶、NAD合成酶和脱氨基氧化型辅酶NAD生成氧化型辅酶，通过检测辅酶浓度测得不对称二甲基精氨酸浓度的方法和试剂盒。

背景技术

不对称二甲基精氨酸(ADMA)是一种可在人血和人尿中检测到的内源性分子，在体内甲基化蛋白的水解过程中形成。ADMA可通过抑制一氧化氮合成而发挥生物学作用。不断有新增的临床研究证明ADMA和重要不良心血管事件或死亡的发生率之间存在统计学显著的及独立的关联性，进而推断出ADMA作为一种重要的新的心血管风险因子。

相对传统的心血管风险因子而言，ADMA还可以应用在传统风险因子无法解释异常高冠心病发病率病例中(例如血透患者)。目前有研究表明ADMA的升高可能在动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、高胆固醇血症、高血压、糖尿病、慢性肾衰、先兆子痫、高同型半胱氨酸血症、肝脏衰竭、勃起功能障碍等疾病中起着重要的病理生理学作用。

测定血清或血浆中不对称二甲基精氨酸浓度的方法有很多种，包括高效液相色谱(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱-质谱联用法及酶法等。

高效液相色谱及高效液相色谱-质谱联用方法检测，操作复杂，且需要特殊仪器。CN 101438148A(WO2007103124-A2)利用串联质谱法，基于ADMA电离后的荷质比，在使用已知量的内标物基础上测定样本中ADMA的含量。WO2006128419-A1指出在使用特殊物质除去样本蛋白后，利用硅酸盐正相液相色谱串联质谱法，同时添加 13C6-Arginine和D6-ADMA为内标，可同时测定样本中的精氨酸、ADMA、对称二甲基精氨酸(SDMA)。

酶联免疫法(ELISA)：目前主要应用于实验研究。相对液相色谱法稍微方便，其缺点在于样品前处理较繁琐，大部分操作还需手工操作，耗时间长，难以实现完全自动化。目前已经商业化的ELISA试剂盒(DLD Diagnostika GmbH，Germany)分析原理：先使用酰基化试剂将样本中的ADMA酰基化，然后加入酶标板，与结合在固相上的ADMA竞争性结合ADMA多克隆抗体，采用不同水平的标准品与酶标记抗体竞争结合，然后显色读出吸光度，制作标准曲线。样品与标准品同样步骤操作后，在标准曲线上得到对应ADMA浓度；CN 1656123A(WO2003102031-A)利用突变的二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)，即在保证突变DDAH对底物ADMA亲和性且不足以水解成二甲胺和瓜氨酸，并由此提出了利用该突变酶特异性结合ADMA性质的酶联免疫测定法(ELISA)、荧光偏振免疫测定法(FPIA)、放射免疫测定法(RIA)、克隆酶供体免疫测定法(CEDIA)等可能的检测方法，但是目前市场并没有发现其商业化使用的报道；US20090053741A指出，基于ADMA与一氧化氮合成酶的多肽片段结合的特点，提出了一种使用竞争性ELISA的检测方法。

酶法：基于酶的特异性检测，一般重复性好，易于实现自动化，但目前市场上还没有成熟产品。WO200046395-A将待测样品去蛋白后，使用精氨酸酶去除精氨酸干扰，离子交换柱粗分离ADMA后，使用二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)水解ADMA产生二甲胺和瓜氨酸，进而使用比色法测定瓜氨酸含量，测定ADMA含量，但是该方法操作相当繁琐，且时间很长，难以在临床实验室推广；WO2006030620-A1(JP2006081481，A)利用二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)水解ADMA产生二甲胺和瓜氨酸，按照以下几种方法测定：1)二甲胺脱氢酶偶联二甲胺和mPMS生成还原型mPMS，还原型mPMS与甲月替(formazan)试剂(NTB或WST-8)反应后生成甲月替；2)二甲胺在二甲胺单加氧酶作用下偶联NADPH，测定NADPH的下降反应速率；3)瓜氨酸在精氨琥珀酸合成酶作用下生成AMP，而使用荧光素酶(Luciferase)来偶联荧光素测定剩余ATP的含量；4) 瓜氨酸在精氨琥珀酸合成酶作用下生成AMP，偶联磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，进而在丙酮酸氧化酶作用下来检测生成的丙酮酸含量。需要说明的该公开专利并未提到通过AMP脱氨酶来检测AMP含量。由于目前现有技术中还没有成熟的酶法检测ADMA浓度的方法和试剂盒，因此，存在对能方便、灵敏、准确地测定ADMA浓度的方法和试剂盒的需求。

发明内容