[发明专利]疟疾红外期DNA疫苗及其制备方法

权利要求书

1.疟疾红外期DNA疫苗，其特征在于：是将热休克蛋白gp96的N末端片段的编码基因与环子孢子蛋白的编码基因串联后插入真核表达质粒中而得到；所述热休克蛋白gp96的N末端片段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，环子孢子蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的疟疾红外期DNA疫苗，其特征在于：所述热休克蛋白gp96的N末端片段的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，环子孢子蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求1或2所述的疟疾红外期DNA疫苗，其特征在于：所述真核表达质粒为pFLAG-CMV8。

4.权利要求1所述的疟疾红外期DNA疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、重组质粒pMD19 simple T/CSP的构建：先提取疟原虫子孢子的总RNA，通过RT-PCR方法扩增出环子孢子蛋白的全长cDNA，再将所得cDNA克隆入质粒pMD19 simple T中，获得重组质粒pMD19 simple T/CSP；

b、重组质粒pFLAG-CMV8-gp96NTD的构建：先以含有热休克蛋白gp96全长cDNA的质粒为模板，通过PCR方法扩增出热休克蛋白gp96的N末端片段的cDNA，再将所得cDNA克隆入真核表达质粒pFLAG-CMV8中，获得重组质粒pFLAG-CMV8-gp96NTD；

c、重组质粒pFLAG-CMV8-gp96NTD/CSP的构建：先用限制性核酸内切酶从步骤a所得重组质粒pMD19 simple T/CSP中酶切出环子孢子蛋白的全长cDNA，再将所得cDNA克隆入步骤b所得重组质粒pFLAG-CMV8-gp96NTD中，使其位于热休克蛋白gp96的N末端片段cDNA的下游，获得重组质粒pFLAG- CMV8-gp96NTD/CSP，即疟疾红外期DNA疫苗。

5.根据权利要求4所述的疟疾红外期DNA疫苗的制备方法，其特征在于：步骤a是先将疟原虫子孢子的总RNA反转录为总cDNA，再以所得cDNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的上、下游引物进行PCR扩增，获得环子孢子蛋白的全长cDNA，再将所得cDNA直接与质粒pMD19 simple T连接，即得重组质粒pMD19 simple T/CSP。

6.根据权利要求4所述的疟疾红外期DNA疫苗的制备方法，其特征在于：步骤b是以含有热休克蛋白gp96全长cDNA的质粒为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的上、下游引物进行PCR扩增，获得热休克蛋白gp96的N末端片段的cDNA，再将所得cDNA用限制性核酸内切酶NotⅠ和BglⅡ双酶切后，与经同样双酶切的真核表达质粒pFLAG-CMV8连接，即得重组质粒pFLAG-CMV8-gp96NTD。

7.根据权利要求4所述的疟疾红外期DNA疫苗的制备方法，其特征在于：步骤c是用限制性核酸内切酶BamHⅠ从步骤a所得重组质粒pMD19 simple T/CSP中酶切出环子孢子蛋白的全长cDNA；同时，将步骤b所得重组质粒pFLAG-CMV8-gp96NTD用限制性核酸内切酶BamHⅠ和BglⅡ双酶切并进行去磷酸化处理，获得去磷酸化的线性化pFLAG-CMV8- gp96NTD；再将酶切出的环子孢子蛋白的全长cDNA与去磷酸化的线性化pFLAG-CMV8- gp96NTD连接，即得重组质粒pFLAG-CMV8-gp96NTD/CSP。