[发明专利]疟疾红外期DNA疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种疟疾疫苗及其制备方法。

背景技术

疟疾仍然是全球最严重的感染性疾病之一。由于疟原虫抗药性和蚊媒耐药性的出现和蔓延，疟疾的药物防治面临困境，研制新型、高效、安全的疟疾疫苗成为当前的迫切需要。

疟疾疫苗主要有红内期疫苗、蚊期传播阻断疫苗和红外期疫苗三种。目前有效的疟疾疫苗只有减毒子孢子红外期疫苗，其能诱导小鼠、猩猩和人产生长期有效的保护性免疫，且获得的保护性免疫具有种特异性而无株特异性，从而不受遗传背景的限制。虽然由于子孢子来源的限制和放射减毒程度控制的困难，减毒子孢子在实际应用中受到明显的限制，但其仍然是研究红外期保护性免疫机制和红外期疟疾亚单位疫苗设计的重要模型。

研究证实，减毒子孢子诱导的保护性免疫主要包括两方面：一方面通过诱导子孢子特异的抗体中和并抑制子孢子入侵肝细胞，另一方面通过活化疟原虫特异的CD8⁺ T细胞杀灭侵入肝细胞的疟原虫。进一步研究证实，环子孢子蛋白（CSP）是减毒子孢子诱导完全保护性免疫的主要抗原；抗CSP抗体，尤其是CSP特异的CD8⁺ T细胞是减毒子孢子的主要效应分子。因此，能否以及如何活化CSP特异的抗体和CD8⁺ T细胞是设计新型红外期疟疾亚单位疫苗的关键。但现有的主要基于CSP设计的疟疾红外期亚单位疫苗，在免疫后不能同时诱导抗CSP抗体产生和CD8⁺ T细胞反应，免疫保护的效率和持续时间均不能达到WHO关于有效疟疾疫苗的标准。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种疟疾红外期DNA疫苗，能够同时诱导抗CSP抗体产生和CD8⁺ T细胞反应，从而获得疟原虫特异的完全保护性免疫。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

疟疾红外期DNA疫苗，是将热休克蛋白gp96的N末端片段（简称gp96NTD）的编码基因与CSP的编码基因串联后插入真核表达质粒中而得到；所述gp96NTD的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，CSP的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步，所述gp96NTD编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，CSP编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步，所述真核表达质粒为pFLAG-CMV8。

本发明的目的之二在于提供所述疟疾红外期DNA疫苗的一种制备方法，操作简便，成本低。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述疟疾红外期DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：

a、重组质粒pMD19 simple T/CSP的构建：先提取疟原虫子孢子的总RNA，通过RT-PCR方法扩增出CSP全长cDNA，再将所得cDNA克隆入质粒pMD19 simple T中，获得重组质粒pMD19 simple T/CSP；

b、重组质粒pFLAG-CMV8-gp96NTD的构建：先以含有热休克蛋白gp96全长cDNA的质粒为模板，通过PCR方法扩增出gp96NTD cDNA，再将所得cDNA克隆入真核表达质粒pFLAG-CMV8中，获得重组质粒pFLAG-CMV8- gp96NTD；

c、重组质粒pFLAG-CMV8-gp96NTD/CSP的构建：先用限制性核酸内切酶从步骤a所得重组质粒pMD19 simple T/CSP中酶切出CSP全长cDNA，再将所得cDNA克隆入步骤b所得重组质粒pFLAG-CMV8-gp96NTD中，使其位于gp96NTD cDNA下游，获得重组质粒pFLAG-CMV8-gp96NTD/CSP，即疟疾红外期DNA疫苗。

进一步，步骤a是先将疟原虫子孢子的总RNA反转录为总cDNA，再以所得cDNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的上、下游引物进行PCR扩增，获得CSP全长cDNA，再将所得cDNA直接与质粒pMD19 simple T连接，即得重组质粒pMD19 simple T/CSP。