[发明专利]一种快速磁分离法主导的肝癌甲胎蛋白变异体检测试剂盒

权利要求书

1.一种磁分离法主导的快速肝癌甲胎蛋白变异体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如下物质：(1)一种含有0.5％-10％重量的凝集素修饰的磁珠作为固相载体的pH为7.1-7.9的结合缓冲液，其中，所述的凝集素为扁豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、刀豆素A、麦胚素、蓖麻凝集素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、荆豆凝集素、双花扁豆凝集素或槐凝集素；凝集素修饰的磁珠和磁珠所含的凝集素的重量百分比为4-200∶1；所述的缓冲液含有25mM的Tris-Hcl、25mM的氯化钠、2mM的氯化镁和2mM的氯化钙的水溶液；(2)一种pH为7.1-7.9的清洗缓冲液，上述的清洗缓冲液含有50mM的Tris-Hcl、50mM的氯化钠、2mM的MgCl₂和2mM的CaCl₂的水溶液；(3)和一种pH为6.5-7.0的洗脱缓冲液；上述的洗脱缓冲液含有0.25M的甲基-a-D-甘露糖、50mM的Tris-Hcl和0.5M的氯化钠的水溶液；所述的Tris为三羟甲基氨基甲烷。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的凝集素修饰的磁珠粒径在1-100000nm。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的凝集素修饰的磁珠粒径为300-30000nm。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的凝集素修饰的磁珠和凝集素的重量百分比为4-200∶1。

5.如权利要求1或4所述的试剂盒，其特征在于，所述的凝集素为扁豆凝集素.

6.一种如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，

(1)所述凝集素修饰的磁珠的制备方法包括吸附、偶联或包裹的方法，或者将含有或不含有氨基或羧基的固含量为0.5％-30％磁珠与凝集素混合，加入缩合剂反应0.5-48小时，磁分离洗涤除去未反应的缩合剂；所述的磁珠与缩合剂的质量比是1-5∶1-20；所述的磁珠与亲和吸附剂混合的质量比是1-15∶1-5；所述的缩合剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N，N”-羰基二咪唑、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶或N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种；所述的缩合剂如权利要求1所述；

(2)所述的结合缓冲液的配置方法为：称取3.0g三羟甲基氨基甲烷、1.45g氯化钠、0.4g氯化镁、0.22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，加入少量浓盐酸，调节pH值在7.1-7.9；再加蒸馏水终体积至1000ml、；

(3)将(1)的凝集素修饰的磁珠和(2)的结合缓冲液配置成为有0.5％-10％重量的凝集素修饰的磁珠作为固相载体的pH为7.1-7.9缓冲液；

(4)所述的清洗缓冲液的配置方法为：称取6.05g三羟甲基氨基甲烷、2.9g氯化钠、0.4g氯化镁、、、0.22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，加入少量浓盐酸，调节pH值在7.1-7.9；再加蒸馏水终体积至1000ml；

(5)所述的洗脱缓冲液的配置方法为：称取6.05g三羟甲基氨基甲烷、29g氯化钠、48.5g甲基-a-D-甘露糖溶解于950ml蒸馏水中，加入少量浓盐酸，调节pH值在6.5-7.0；再加蒸馏水终体积至1000ml。

7.一种如权利要求1所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒用于检测肝癌甲胎蛋白变异体。

8.如权利要求7所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒的使用是将凝集素修饰的磁珠作为固相载体在结合缓冲液中与待测样品中的AFP-L3结合；在清洗缓冲液中将AFP-L3与凝集素修饰的磁珠分离；在洗脱缓冲液中将凝集素修饰的磁珠上结合的AFP-L3洗脱下来；利用检测系统对洗脱下来AFP-L3进行定性或定量的检测。

9.如权利要求5或8所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒的使用(1)取500μl-1ml含有0.5％-10％重量的凝集素修饰的磁珠的pH为7.1-7.9的缓冲液，在放置磁铁的磁架上静置进行磁分离2-5分钟后，弃上清液获得含有70％-99.8％重量的凝集素修饰的磁珠；

(2)在(1)获得的磁珠中加入500ul-1mlpH为7.1-7.9的结合缓冲液，充分混匀平衡反应系统后，在放置磁铁的磁架上静置进行磁分离2-5分钟后，弃上清液；

(3)在(2)获得的磁珠中加入475μl-900ul的pH为7.1-7.9结合缓冲液，得混合液A；将25ul-100ul血清或肝腹水样品加入到混合液A中，混合均匀，静置5-10分钟；在放置磁铁的磁架上静置进行磁分离2-5分钟后，弃上清；

(4)在(3)获得的磁珠中加入500ul-1mlpH为7.1-7.9的的Tris-Hcl清洗缓冲液清洗5-6次(旋转清洗)，在放置磁铁的磁架上静置进行磁分离2-5分钟后，弃上清；

(5)在(4)获得的磁珠中加入500μl-1ml的含甲基-a-D-甘露糖的Tris-Hcl pH为6.5-7.0的洗脱缓冲液，充分混匀，室温静置5-10分钟，在放置磁铁的磁架上静置进行磁分离2-5分钟后，收集上清液，为含有肝癌甲胎蛋白变异体的分离液；

(6)用金标试纸条对(5)获得的肝癌甲胎蛋白变异体分离液进行定性或半定量检测，或者用酶标法、化学发光法或萤光法进行定性或定量检测(5)获得的肝癌甲胎蛋白变异体分离液。