[发明专利]一种细胞DNA文库及其构建方法

权利要求书

1.一种细胞DNA文库构建方法，所述方法包括，对同一细胞样本依次进行染色质免疫共沉淀处理及亚硫酸氢盐处理，并对处理后产物进行扩增得到所述细胞DNA文库。

2.根据权利要求1所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于：所述方法包括步骤：

a、在活体细胞状态下进行交联反应，使DNA与DNA上结合的蛋白质交联固定；

b、将交联固定后的染色质打断至片段长度为200～500bp；

c、采用染色质免疫共沉淀的方法从打断后的染色质中分离得到与目的蛋白质相结合的DNA片段；

d、将分离的DNA片段采用亚硫酸氢盐处理使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。

3.根据权利要求2所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于：所述在步骤c之后及步骤d之前还包括步骤c+1，将分离的DNA片段进行末端修复，使其成为平末端，并在DNA片段3’末端加上“A”碱基，使其形成“T-A”粘性末端，然后连接甲基化测序接头；

在步骤d之后还包括步骤d+1，使用与甲基化测序接头相匹配的引物进行PCR扩增得到所述细胞DNA文库。

4.根据权利要求2或3所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于：所述步骤a中，进行交联反应的活体细胞起始量为不低于10E6数量级，所述交联反应为甲醛交联反应，交联反应所用甲醛的终浓度为0.8-1.2％优选1％，甲醛交联时间为5-20min优选10min。

5.根据权利要求4所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于：所述步骤b中，染色体打断采用非接触式超声破碎仪进行超声波打断，且超声频率为200w～320w，打断条件为超声25-35秒on/0.5-3min off，共6-8个循环，优选30秒on/2min off，共7个循环。

6.根据权利要求4所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于：所述步骤c中，染色质免疫共沉淀方法选用目的蛋白的特异性抗体及免疫磁珠来分离DNA片段，

所述步骤c包括，将免疫磁珠与特异性抗体混合制备磁珠-抗体反应物，然后将步骤b打断的染色质与磁珠-抗体反应物混合进行免疫沉淀反应，之后进行反交联反应，并纯化得到与蛋白质分离的DNA。 

7.根据权利要求6所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于：所述特异性抗体为H3K4me3，所述免疫磁珠为分别包被有protein A和protein G的protein A磁珠和protein G磁珠，所述抗体H3K4me3的用量为3～4.5μg优选4μg，protein A磁珠和protein G磁珠的用量为300～600μg优选600μg且两者的用量比为1∶1。

8.根据权利要求6或7所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于：所述反交联反应的时间为2～16h优选3h。

9.根据权利要求2或3所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于：所述步骤d的亚硫酸氢盐处理包括使用可溶性亚硫酸氢盐使胞嘧啶磺酸化，对苯二酚脱氨基，再在碱性环境下，使磺基消失，成为尿嘧啶。

10.采用权利要求1～9任意一项所述的细胞DNA文库构建方法制备得到的细胞DNA文库。