[发明专利]一种细胞株的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术，特别涉及在CHO哺乳动物细胞中重组表达单克隆抗体，并筛选稳定的高表达细胞株的工艺。

背景技术

目前单克隆抗体已越来越广泛地用于治疗传统药物难以治愈的疾病，如自身免疫疾病、肿瘤等对人类密切相关的疾病。由于抗体药物在临床使用时需要的剂量大，而且主要是通过静脉滴注进入人体，因此高表达和高纯度是抗体进入临床应用的必要环节(Doner et al.1989，J Bio Chem，264：20602-7；Malm，1987，J Immunol Methods，104：103-9)。所以获得稳定高表达的细胞株成为非常关键的因素(Nature Biotechnology，2004，22：1393)。

常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(dhfr^-)，CHO(dhfr^-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点。选择标记和基因扩增CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。一类是neo等非扩增基因。另一类具有基因扩增的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolate reductase，DHFR)，谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase，GS)。

目前，真核细胞DHFR表达系统主要是通过生长代谢选择压力来获得高表达的细胞株(Birch and Racher，Advanced Drug Delivery Reviews 2006，58：671)。通过增加MTX的培养浓度来增加DHFR基因在染色体年拷贝数，来达到增加外源基因的表达水平的，而更高的MTX浓度更易导致细胞株的不稳定(Kim et al.1998，Biotechnology Bioengineering，58：73-84)。所以选择低的MTX浓度有利于筛选得到稳定的细胞株。抗体的表达很大程度上依赖于轻链的表达，合适的H/L比例可以促进完整抗体的分泌(Schlatter et al.，2005，Biotechnology Progress，21：122-133)。目前，国内报道的真核细胞表达人源化抗体的产量均较低，难以实现产业化并实际应用。抗体产量最好在50mg/L以上(Beidler et al，1988，J Immunol，141：4053-60)，如此才能达到产业化的最低要求。

发明内容

本发明是针对现有细胞表达系统效率低，难以获得稳定高表达细胞株的问题，公开了一种引入抗性筛选的细胞表达系统。

一种细胞株的筛选方法，包括将轻重链序列转入不同质粒载体，然后转染细胞和利用选择标记进行细胞筛选的步骤，其特征在于，将所述的重链序列插入带有选择标记的筛选基因的载体，将所述的轻链序列插入带有抗性基因的载体上，二者共同转染共扩增基因表达系统细胞后，先用抗性培养基筛选阳性克隆，然后进行压力筛选扩增表达。

所述重链序列插入带有DHFR筛选基因的载体，所述轻链序列插入带有Zeocin抗性基因载体上。

在一个实施方案中，所述的抗性筛选培养基为含有Zeocin抗性筛选培养基。所述的Zeocin筛选浓度为100-400ug/ml，优选为200-250ug/ml。

在本发明的实施例中，应用CHO细胞DHFR表达系统，将轻重链分别插入二种表达载体中共转染CHO细胞，为保证细胞能同时表达HL链，也为了增加筛选概率，同时加入了Zeocin抗性筛选。抗体的表达水平很大程度上依赖于轻链的表达，所以在高表达的细胞株中，轻链的过度表达有利于完整抗体分子的分泌，且有利于后续工艺中的蛋白纯化。

本发明的一具体实施例的筛选方案包括以下工艺步骤：

在一个实施方案中，筛选培养基选用含有HT成分的DMEM/F12培养基。为获得高表达的细胞株，选择合适的培养基同样非常重要，在本发明的一实施例中，筛选培养基选用含有HT成分的DMEM/F12培养基，以补偿单细胞培养过程中DHFR缺陷型细胞的代谢，有利于克隆的形成，进而筛选到高表达的细胞株。