[发明专利]抗小麦矮缩病毒的RNA干涉载体、构建方法及其在小麦遗传转化中的应用

权利要求书

1.抗小麦矮缩病毒的RNA干涉载体，包括骨架载体和含有正、反义链的发夹结构，其特征在于：以SEQ ID NO9所示的WDV-CP基因序列作为正、反义链。

2.根据权利要求1所述的RNA干涉载体，所述骨架载体为pMCG161。

3.根据权利要求2所述的RNA干涉载体，所述WDV-CP基因的正义链插入pMCG161中上游的两个酶切位点AscI、AvrII间，WDV-CP基因的反义链插入pMCG161中下游的两个酶切位点SpeI、SgfI间。

4.权利要求3所述的RNA干涉载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)WDV-CP基因的获得

以陕西韩城SXHC-2样品的总DNA为模板，以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2为引物对，经PCR扩增WDV-CP得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP；

SEQ ID NO1：5’-ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’，

SEQ ID NO2：5’-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’，

(2)WDV-CP正义链载体的获得

以阳性质粒pMD18-T-WDV-CP为模板，以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4为引物对，经PCR扩增得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP+，用AscI、AvrII双酶切阳性质粒和载体pMCG161，再用T4DNA连接酶将正义链片段和载体连接，得到WDV-CP正义链载体；

SEQ ID NO3：5’-AT GGCGCGCC ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’，

SEQ ID NO4：5’-AT CCTAGG TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’，

(3)WDV-CP干涉载体的获得

以阳性质粒pMD18-T-WDV-CP为模板，以SEQ ID NO5和SEQ ID NO6为引物对，经PCR扩增得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP-，用SpeI、SgfI双酶切阳性质粒和WDV-CP正义链载体，再用T4DNA连接酶将反义链片段和正义链载体连接，得到干扰载体pMCG161+/-WDV；

SEQ ID NO5：5’-AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’，

SEQ ID NO6：5’-AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’。

5.权利要求4所述的构建方法的第(3)步WDV-CP干涉载体的获得用下列方法替代：

A)WDV-CP反义链载体的获得

以阳性质粒pMD18-T-WDV-CP为模板，以SEQ ID NO5和SEQ ID NO6为引物对，经PCR扩增得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP-，用SpeI、SgfI双酶切阳性质粒和载体pMCG161，再用T4DNA连接酶将反义链片段和载体连接，得到反义链载体pMCG161-WDV；

SEQ ID NO5：5’-AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’

SEQ ID NO6：5’-AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’

B)WDV-CP干涉载体的方法

用AscI、AvrII双酶切pMD18-T-WDV-CP+阳性质粒和WDV-CP反义链载体，再用T4DNA连接酶将正义链片段和酶切后的WDV-CP反义链载体连接，得到干扰载体pMCG161+/-WDV。

6.权利要求2-4任一所述RNA干涉载体在遗传转化单子叶植物中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，是将上述RNA干涉载体转化单子叶受体植物，使之对小麦矮缩病毒产生抗性。

8.根据权利要求7所述应用，所述转化方法为基因枪法。

9.根据权利要求8所述应用，所述受体植物为禾本科植物。

10.根据权利要求9所述应用，所述禾本科植物为小麦。