[发明专利]抗小麦矮缩病毒的RNA干涉载体、构建方法及其在小麦遗传转化中的应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。本发明特别涉及一种适合单子叶植物遗传转化抗小麦矮缩病毒的RNA干涉载体的构建及其在小麦遗传转化中的应用。进一步涉及小麦矮缩病毒(WDV)的外壳蛋白(CP)基因表达载体及其遗传转化小麦并得到有抗性的植株。

背景技术

小麦矮缩病(wheat dwarf disease)是小麦重要病害之一。它是由小麦矮缩病毒(Wheatdwarf virus，WDV)引起。小麦矮缩病毒的传毒介体是条沙叶蝉，它以成、若虫刺吸作物茎叶，导致受害幼苗变色，生长受到抑制。20世纪80年代最先在瑞典报道了小麦矮缩病毒的发生(Kvarnheden等，2002)。近年来，该病毒已经在非洲、欧洲、亚洲、和大洋洲引起了严重的经济损失。2007年本实验室在国内首次报道了该病毒引起矮缩病的发生。随后在陕西、甘肃、河北、云南等12个省被发现。该病在陕西北部麦区已经引起严重的减产，如2007和2008年陕西韩城发病面积超过10万亩，病株率20％以上，重病田达1万亩。目前小麦矮缩病已经成为威胁我国西北、华北和西南麦区重要的病毒病。

目前农业生产上防治此类病害的主要方法：化学药剂、耕作措施和抗病育种。化学药剂容易造成人蓄中毒、农药残留和环境污染等危害；轮作换茬等耕作措施不能根除病害；综合比较来看培育抗病小麦新品种是比较有效的防治措施，但由于小麦抗病种质资源的缺乏，常规育种方法又存在周期长、定向性差、易带入不良性状等缺点，因此单靠传统育种培育抗病害的小麦新品种的方法获得抗病、高产优质的双重特性品种的难度很大。于是小麦生物技术抗病育种应运而生。

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默现象，它是指通过双链RNA介导的特异性的降解对应序列的mRNA，从而特异性地抑制相应基因的表达，是植物对外来入侵者的一种重要的防御机制

近年来，RNAi技术在研究植物病毒基因功能与致病机制和植物抗病机理中有了广泛应用，但在国内外RNAi介导的WDV抗性还未见报道。

发明内容

针对上述不足，本发明在WDV(来自陕西韩城SXHC-2样品，目前序列还未登录GenBank)上设计了WDV高保守性的外壳蛋白(CP)介导的RNAi的dsRNA前体，将WDV-CP基因连接到双向干涉载体pMCG161载体的正义链位点，而后在正义链载体的基础上将WDV-CP基因连接到双 向干涉载体pMCG161载体的反义链酶切位点上，最终构建了适合禾本科植物转化的干涉载体。利用基因枪的方法进行小麦的遗传转化，借助小麦组织中RdRp的转录作用，产生WDV-CP基因的dsRNA的形式，再由Dicer酶的作用产生SiRNA，当小麦受WDV侵染时，就可产生SiRNA，从而达到利用RNAi介导对WDV的抗性的目的。但由于本发明所选择的序列为WDV的保守序列，因此所得到的转基因植株可以使入侵的致病病毒发生RNA沉默现象，且这种沉默具有普遍性，从而使植物对病毒具备普遍的抗性。期望筛选出免疫或高抗WDV的转基因小麦植株，探索利用分子生物学技术获得抗WDV的基因工程新策略，最终实现利用RNAi获得抗WDV小麦新品种的预期目标。

依据现有的WDV的保守序列设计引物，PCR扩增小麦矮缩病毒陕西韩城SXHC-2样品的cp基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO9所示。

抗小麦矮缩病毒的RNA干涉载体，包括骨架载体和含有正、反义链的发夹结构，其特征在于：以SEQ ID NO9所示的WDV-CP基因序列作为正、反义链。

所述骨架载体为pMCG161。

所述WDV-CP基因的正义链插入pMCG161中上游的两个酶切位点AscI、AvrII间，WDV-CP基因的反义链插入pMCG161中下游的两个酶切位点SpeI、SgfI间。

上述干涉载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)WDV-CP基因的获得

以陕西韩城SXHC-2样品的总DNA为模板，以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2为引物对，经PCR扩增WDV-CP，得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP。

SEQ ID NO 1：5’-ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’

SEQ ID NO2：5’-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’

(2)WDV-CP正义链载体的获得