[发明专利]双抗大麦黄矮病毒和小麦矮缩病毒的RNA干涉载体、构建方法及在小麦遗传转化中的应用

权利要求书

1.双抗大麦黄矮病毒和小麦矮缩病毒的RNA干涉载体，包括骨架载体和含有正、反义链的发夹结构，其特征在于：以SEQ ID NO13所示的BW-CP基因序列作为正、反义链。

2.根据权利要求1所述的RNA干涉载体，所述骨架载体为pMCG161。

3.根据权利要求2所述的RNA干涉载体，所述BW-CP基因的正义链插入pMCG161中上游的两个酶切位点AscI、AvrII间，BW-CP基因的反义链插入pMCG161中下游的两个酶切位点SpeI、SgfI间。

4.权利要求3所述的RNA干涉载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)以感染大麦黄矮病毒小麦总DNA为模板，以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2为引物对，经RT-PCR扩增BYDV-GAV-CP，得到PCR产物I，

所述SEQ ID NO1：(BYDV-GAV-CP)5’-ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA-3’，

所述SEQ ID NO2：(BYDV-GAV-CP)5’-CTATTTGGGAGTCATGTTGGC-3’，

(2)以感染小麦矮缩病毒小麦总DNA为模板，以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4为引物对，经PCR扩增WDV-CP，得到PCR产物II，

所述SEQ ID NO3：(WDV-CP)5’-ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’，

所述SEQ ID NO4：(WDV-CP)5’-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’，

(3)以PCR产物I和II的1∶1混合物为模板，以SEQ ID NO5和SEQ ID NO6为引物对，经PCR扩增得到PCR产物III，目的片段为1383bp，回收PCR产物III，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH 5α，得到阳性质粒pMD18-T-BW-CP，

SEQ ID NO5：BW-CP：5’-GCCAACATGACTCCCAAATAGATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’，

SEQ ID NO6：BW-CP：5’-GGGAGTCCTTGTTGGTCACCATCTATTTGGGAGTCATGTTGGC-3’，

(4)以阳性质粒pMD18-T-BW-CP为模板，以SEQ ID NO7和SEQ ID NO8为引物对，经PCR扩增，得到PCR产物IV，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-BW-CP+，用AscI、AvrI双酶切阳性质粒和载体pMCG161，再用T4DNA连接酶将正义链片段和载体连接，得到正义链载体pMCG161+BW；

SEQ ID NO.7：BW-CP+：5’-ATGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA-3’，

SEQ ID NO.8：BW-CP+：5’-ATCCTAGGTTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’，

(5)以阳性质粒pMD18-T-BW-CP为模板，以SEQ ID NO9和SEQ ID NO10为引物对，经PCR扩增，得到PCR产物V，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-BW-CP-，用SpeI、SgfI双酶切阳性质粒pMD18-T-BW-CP-和pMCG161+BW，再用T4DNA连接酶将反义链片段和载体连接，得到干扰载体pMCG161+/-BW；

SEQ ID NO9：BW-CP-：5’-ATGCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG -3’，

SEQ ID NO 10：BW-CP-：5’-ATACTAGT ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA -3’。