[发明专利]双抗大麦黄矮病毒和小麦矮缩病毒的RNA干涉载体、构建方法及在小麦遗传转化中的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。特别是涉及一种适合单子叶植物遗传转化、并兼抗两种病毒病的RNA干涉载体的构建及其在小麦遗传转化中的应用。进一步涉及大麦黄矮病毒BYDV-GAV和小麦矮缩病毒WDV的外壳蛋白(CP)基因的表达载体的构建及其遗传转化并得到双抗性小麦植株。

背景技术

小麦黄矮病是小麦重要病害之一。它是由蚜虫传播的大麦黄矮病毒(Warleyyellow dwarfvirus，BYDVs)引起的。感病的小麦表现为代谢紊乱、叶片发黄、植株矮化、有效分孽减少、穗粒数和千粒重降低而严重减产，因此该病有“黄色瘟疫”之称。

根据不同种的麦蚜传播大麦黄矮病毒的能力不同，美国学者Rochow将大麦黄矮病毒划分成5个株系，PAV、MAY、SGV、RPV和RMV。在国内周广和等将我国的大麦黄矮病毒分离物划分为GAV、GPV、PAGV和RMV，其中GPV为我国特有的株系。几乎所有种植小麦的国家均发生过此病。1978年美国小麦黄矮病大爆发使其减产60-80％，1988年德国发生小麦黄矮病，使其冬小麦减产40％。我国在1966、1970、1973、1978、1980等五年均发生过该病，平均每次产量损失达20％以上。目前该病害在我国西北、华北、西南及华东等近20个省、市、自治区的冬春麦区每年都有不同程度的为害。其中以豫西、晋南、关中、陇东及华东和西南地区为冬小麦的主要流行区，甘肃省河西走廊、陕北等地为冬春麦混种流行区，宁夏、内蒙古、晋北、冀北及东北地区为春小麦的主要流行区。近年有加重趋势。

小麦的另一个主要病害是小麦矮缩病(Wheat dwarf disease)，是由小麦矮缩病毒(Wheatdwarf virus，WDV)引起的。WDV的传毒介体是条沙叶蝉，它以成虫、若虫刺吸作物茎叶，导致受害幼苗变色，生长受到抑制。20世纪80年代最先在瑞典报道了小麦矮缩病毒的发生(Kvarnheden等，2002)。近年来，小麦矮缩病已经在非洲、欧洲、亚洲和大洋洲引起了严重的经济损失。2007年本实验室在国内首次报道了小麦矮缩病毒引起矮缩病的发生。随后该病在陕西、甘肃、河北、云南等12个省被发现。其中陕西北部麦区已经引起严重的减产，如2007和2008年陕西韩城发病面积超过10万亩，病株率20％以上，重病田达1万亩，目前该病已经成为威胁我国西北、华北和西南麦区的重要病毒病。

目前农业生产上防治这两种病害的主要方法：化学药剂、耕作措施和抗病育种。化学药 剂容易造成人蓄中毒、农药残留和环境污染等危害；轮作换茬等耕作措施不能根除病害。综合比较而言，培育抗病害的小麦新品种是有效的防治措施，但是由于小麦抗病种质资源的缺乏，常规的育种方法又存在周期长、定向性差、易带入不良性状等缺点，常规育种方法培育抗病害的小麦新品种已经不能满足人类和社会发展的需要，因此小麦生物技术抗病育种应运而生。

近年来，RNA干涉(RNA interference，RNAi)在研究植物病毒基因功能、致病机制和植物抗病机理中有了广泛应用。RNAi技术是由RNA介导的通过特异性的相互作用来抑制基因表达的遗传干涉现象。它能够特异、有效地降解mRNA，从而引起转录后水平的基因沉默。当表达来源与病毒某一基因或核苷酸序列的转基因植物发生RNA沉默时，能对入侵的同一病毒或同属中相近病毒的RNA进行降解，使入侵的病毒不能在植物中积累，从而赋予转基因植物病毒抗性。近年来，虽然RNAi技术在植物病毒基因工程中有了广泛应用，但是在国内外RNAi介导的BYDV-GAV和WDV双抗性还未见报道。

本实验以近年在我国主麦区严重发生的大麦黄矮病毒BYDV-GAV和小麦矮缩病毒WDV为研究重点，利用植利用植物转基因工程技术将BYDV-GAV-CP和WDV-CP核苷酸片段导入小麦，通过其特异地干扰、降解或沉默BYDV-GAV和WDV基因在小麦植株内的正常复制、积累和传播，筛选获得分别或同时抗BYDV-GAV和WDV的小麦品系，为进一步结合常规育种工作，改良现有的优质高产但不抗病的小麦品种，以便实现利用转基因技术获得免疫或高抗BYDV-GAV和WDV的小麦新品系的目的。

发明内容