[发明专利]一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及生物样品中的细胞裂解与核酸提取纯化。

背景技术

核酸(包括DNA和RNA)提取纯化是分子生物学中的一项基本操作。在细胞中核酸总是与各种蛋白质结合在一起的，核酸提取分离主要是指将核酸从生物样品细胞中释放到胞外，并与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子分开，提取的核酸应保证其分子一级结构的完整性，并排除其它杂质分子污染，才能更好满足下游核酸杂交、扩增、测序等分子生物学基因操作或临床基因检测对核酸模板质量的要求。

目前在分子生物学或临床基因诊断中常见的核酸提取纯化方法有：经典的酚氯仿提取法、表面活性剂加热碱裂解提取法、基于二氧化硅吸附的硅胶膜(或玻璃纤维膜，下同)离心柱法核酸提取，以及基于二氧化硅表面修饰磁性颗粒(磁珠)吸附的核酸提取等。目前经典方法由于操作复杂，提取结果不稳定在临床基因检测中已较少使用；表面活性剂加热碱裂解法提取虽然操作简便，但由于提取的核酸含有大量杂质，容易影响了下游检测导致结果假阴性；离心柱法和磁珠法提取的核酸纯度较高，且能实现操作自动化，具有提取高效、便捷、大通量的优点，代表了未来临床诊断中核酸提取技术的发展方向。

目前，市场上已经有许多硅胶膜离心柱法或磁珠法核酸提取试剂用于生物样品处理与核酸提取，其中的细胞裂解液通常含有高离盐和表面活性剂等成分，高离盐主要是胍盐，包括异硫氰酸胍、盐酸胍等，表面活性剂主要有十二烷基磺酸钠(SDS)、Tween 20、Triton X-100、NP-40、十二烷基肌氨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等，它们能使蛋白质变性进而细胞膜破裂，释放的核酸在高离环境中与硅胶膜或磁珠吸附结合，进一步通过洗涤步骤除去硅胶膜或磁珠表面的杂质，最后经过洗脱步骤可以获得纯化的核酸(专利200710009524.7；200810200588.X；201010135963.4)。在实际操作中，由于胍盐具有降低溶液pH值的作用，这些细胞裂解液中的胍盐在pH值近中性或偏酸性的条件容易产生沉淀，不仅带来试剂需要加热溶解和吸取操作不方便的不足，而且影响样品中细胞裂解效果、降低了核酸提取的得率。

发明内容

本发明的目的是提供一种改进的细胞裂解试剂，它呈碱性并含有胍盐、铵根离子和表面活性剂成分，能在碱性液相环境下裂解生物样品中的细胞，并促进释放的核酸与基于二氧化硅材质的固相材料吸附结合，最后通过对固相材料的洗脱步骤，获得纯净的核酸，改进的细胞裂解试剂提取生物样品核酸具有细胞裂解充分、操作简便、核酸提取得率高的优点，适合于分子生物学基因操作或临床基因诊断领域中各种类型生物样品的核酸提取纯化。

技术方案

本发明提供一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂，试剂呈碱性且主要成分为胍盐、铵根离子和表面活性剂，具体组成说明如下：

(1)胍盐：可以是但不限于异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍、碳酸胍、磷酸胍、硝酸胍等，在试剂中的浓度为2-8M，优选的胍盐为异硫氰酸胍和盐酸胍，浓度为6M。

(2)铵根离子：由加入氨水或通入氨气提供铵根离子并保持试剂呈碱性，铵根离子浓度为0.1-1M、试剂pH值8-13，优选的铵根离子浓度为0.5M、试剂最终pH值约9.0。

(3)表面活性剂：可以是但不限于SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40、十二烷基肌氨酸钠、CTAB等或其中1-3种的组合，浓度为1-20％，优选的表面活性剂为SDS和Triton X-100，优选的浓度各为1％和10％。

此外，细胞裂解试剂中还可以有pH缓冲介质(50mM Tris-HCl)和金属螯合剂(25mM EDTA)，用于稳定体系pH值，并除去作为核酸酶活性辅因子的金属离子。

配制的细胞裂解试剂适合置于室温保存。

使用方法

本发明还提供了细胞裂解试剂的使用方法之一如下：

(1)细胞裂解与核酸释放：细胞裂解试剂与全血、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液、细胞和组织培养液等生物样品等体积均匀混合，室温放置10min；泌尿生殖道或咽拭子样品需先用生理盐水振荡清洗，然后吸取漂洗液加入细胞裂解试剂提取核酸。

(2)生物样品裂解混合液与固相材料结合：如固相材料为硅胶柱，则将混合液上柱离心弃滤液，柱子硅胶膜上结合吸附有核酸；如固相材料为磁性颗粒，则在第一步样品裂解时就将磁性颗粒加入混合液一起放置，每2min将液体中的磁珠混匀悬浮一次，10min后加磁吸弃液体，磁性颗粒上结合吸附有核酸。