[发明专利]一种人胰岛素原融合蛋白及人胰岛素的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种人胰岛素原融合蛋白及人胰岛素的制备方法。

背景技术

胰岛素是一种非糖基化的由二硫键连接的异源多肽二聚体，共由51个氨基酸组成，分别是21个氨基酸的A肽和30个氨基酸的B肽，由A7-B7和A20-B19之间的两对二硫键连接，另外在A肽还有一个A6-A11的链内二硫键。(图1)

胰岛素是由胰腺β细胞以胰岛素原的形式合成，胰岛素原中B肽的C端通过另外一条肽链C肽与A肽N连接为一条单链。C肽共含有35个氨基酸，其N端为Arg-Arg(RR)而C端为Lys-Arg(KR)。成熟的胰岛素是由β细胞分泌的酶裂解而成，有三种酶参与这一过程：PC1/3和PC2分别裂解B-C连接处和C-A连接处，将C肽首先裂解除去；而羧肽酶H则负责裂解在PC1/3裂解时产生的B肽C端的多余Arg以形成成熟的胰岛素。

治疗用胰岛素的生产方法分为以下几种：1、从动物胰脏提取，如猪胰岛素，目前中国医药市场上动物源的胰岛素还占有很大的份额，为国家基本药物目录所列的品种；2、化学合成；3、半合成：即将猪胰岛素通过化学作用将其A肽末端的Ala转化为Asn，形成人胰岛素；4、重组蛋白发酵表达。

人胰岛素为FDA所批准的第一种重组蛋白药物，近年来，重组表达制备人胰岛素已被成功应用到各种不同的宿主中，包括细菌、酵母、动物细胞甚至植物。但是，其基本原理不外乎以下三种：

1、双链法：

重组人胰岛素最早由美国希望之城的科学家们于1978成功制备，而在1982年作为第一个基因重组蛋白药物被FDA授予礼来公司。最初的方法为将A肽和B肽基因分别与β-半乳糖甘酶(β-gal)基因拼接，融合基因转化不同的大肠杆菌独立发酵，所表达的两个融合蛋白在细胞内形成的包涵体通过复性、氰化溴裂解、生成的A、B两肽体外重组折叠以获得成熟的人胰岛素(Chance et al.，Diabetes Care，1981，4)。然而，β-半乳糖甘酶分子量较大(～1000氨基酸)，导致发酵产物中的胰岛素肽比例偏低，后期β-半乳糖甘酶被色氨酸操纵子的一个约190氨基酸的多肽(Trp-LE)取代，从而使得成熟胰岛素产率大为提升。

实际操作中，由于需要两次不同的发酵过程，并且Trp-LE-Met-A融合肽和Trp-LE-Met-B融合肽氰化溴裂解后的A、B两肽需要进行磺化保护，显然提高了生产成本。因此，现在这种方法已不再用于生产。

2、胰岛素原法(胞内包涵体)：

另外一种方法是将胰岛素原作为一条多肽表达，这一方法消除了双链法里必须的两次发酵。其基本实现方法为将一个引导肽(如Trp-LE-Met)融合在胰岛素原N端进行融合蛋白发酵表达。(Kroeff et al.，J.Chromatogr.1989，46)发酵产生的包涵体溶解后，首先由氰化溴切除引导肽，之后的胰岛素原在磺化保护下复性折叠，正确折叠的产物可使用胰蛋白酶和羧肽酶B裂解并经过多步层析获得胰岛素终产物。(Kemmler et al.，J.Biol.Chem.，1971，246)

Trp-LE-Met作为一个融合标签，其分子大小(～190氨基酸)与胰岛素原(86氨基酸)相比仍旧较大，最终的胰岛素氨基酸占比不到发酵产品的20％。与此同时，使用氰化溴的方式产生的有毒物质的处理以及对氰化溴的管制更给上述方法增加了成本。因此，更短的且具有蛋白酶识别位点的引导肽被相继提出。比如美国专利5126249的Met-Tyr；5378613的Met-Arg和Chen et al.，(Appl.Biochem.Biotechnol.1999，55)描述的Met-Lys以及美国专利5358857，韩国专利(Registration#1002029580000)，Tikhonov et al.(Prot.Exp.Purif.，2002，26)等描述了许多新型引导肽。含有这些引导肽的胰岛素原表达载体多具有高表达量，但在后期酶裂解处理中会产生大量的副产物，使得下游的纯化工作变得困难。中国专利98813941.3描述了以人生长激素作为引导肽，并经由Arg或Lys与胰岛素原相连形成的表达载体，但其胰岛素氨基酸数占比不高，且酶裂解效率较低，复性过程需要消耗大量的脲，生产成本增高。

3、胰岛素原法(分泌可溶)：