[发明专利]预防肠道病毒71型感染的基因重组疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种预防手足口病的基因重组疫苗，其特征在于，其氨基酸序列为SeQ ID NO.8所示的序列，结构为LTB-SP55-SP70。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，是一种细胞内佐剂基因重组口服疫苗，它以大肠埃希氏菌不耐热肠毒素B亚单位LTB为免疫增强佐剂、EV71病毒外壳蛋白VP1中的两段线性中和表位SP55和SP70为抗原，用基因工程技术构建LTB-SP55-SP70融合基因的原核表达质粒，在大肠埃希菌中进行表达，并对重组表达产物进行纯化，制成EV71病毒基因工程疫苗。

3.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所说的LTB-SP55-SP70制备成口服滴丸。

4.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所说的LTB-SP55-SP70制备成口服胶囊。

5.如权利要求1所述疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：1)大肠埃希氏菌LTB基因、EV71病毒SP55和SP70基因密码子优化、合成和测序；2)rLTB-SP55-SP70原核表达系统构建；3)rLTB-SP55-SP70重组蛋白的表达，SDS-PAGE电泳和BioRad凝胶图像分析系统确定表达情况和产量；4)DEAE阴离子交换层析和Ni-NTA亲和层析法纯化rLTB-SP55-SP70；5)采用GM1-ELISA对rLTB-SP55-SP70分子中的rLTB佐剂活性进行鉴定；6)用rLTB-SP55-SP70重组蛋白免疫BALB/c小鼠，对免疫血清的抗体产生情况进行检测，利用体外中和实验测定口服免疫的EV71病毒基因工程疫苗rLTB-SP55-SP70的免疫保护作用。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其中步骤1)所说的大肠埃希氏菌LTB具有序列表中SeQ ID NO.2所示的序列。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中所说的EV71病毒SP55和SP70，是根据大肠埃希氏菌偏好密码子优化而基因合成的EV71病毒基因序列所表达，具有序列表中SeQ ID NO.4和6所示的序列。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2)所构建的表达载体中，LTB是作为一种细胞内分子免疫增强佐剂。

9.一种表达权利要求1疫苗的核苷酸序列，其特征在于，为SeQ ID NO.7所示的序列。

10.表达LTB-SP55-SP70三个亚单位的核苷酸序列，其特征在于，为SeQ ID NO.1，3，5所示的序列。