[发明专利]脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，其制备方法和应用。

背景技术

脑膜炎球菌是世界上细菌性脑膜炎最常见的病因之一，是唯一能引起脑膜炎大规模流行的细菌。脑膜炎球菌病的迅速发展经常在发病后1或2天内导致患者死亡，或造成严重后遗症，甚至在受到最佳医疗的病例中也是如此。化学预防可在密切接触者中防止继发病例发生，但因为继发病例仅占全部脑膜炎球菌病的1％～2％，所以化学预防对控制大多数地方性和流行性疾病价值甚小。因此，用安全有效的疫苗免疫接种是控制脑膜炎球菌病的唯一合理的方法。

在脑膜炎球菌的13个血清群中，A群、B群、C群、W135群和Y群可引起95％的病例(朱展鹰等，2005)。

目前国内外已有A群、C群、A+C群、A+C+Y+W135群等多种单价、二价及四价脑膜炎多糖疫苗和结合疫苗。这些疫苗在接种人群中已证明是非常安全和有效的。

不论是多糖疫苗或结合疫苗的制备过程中，荚膜多糖的制备是关键的步骤。纯化荚膜多糖，目前多采用沉淀法和凝胶层析法，或两者相结合的方法。凝胶层析法影响因素少，纯化环境温和，因而多糖破坏少，但费时费力，每次分离量少；而且，在相对分子质量估计不清楚时，凝胶的选择有一定困难。沉淀法多采用乙醇、丙酮、长链季铵盐类作沉淀剂，该方法无凝胶层析法的缺点，但纯化环境不够温和，影响因素较多。50年代，Scott首先发现十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对酸性多糖有较强的沉淀作用，能与多糖形成季铵络合物而沉淀多糖。目前CTAB广泛用于各种细菌荚膜多糖的纯化制备。CTAB对酸性多糖沉淀作用较强，但对中性多糖、核酸和蛋白质等物质亦有不同程度的沉淀作用。因此，要获得成分均一、纯度较高的荚膜多糖，必须进一步去除参杂其中的核酸和蛋白质类。

目前脑膜炎荚膜多糖的常规提取工艺为：1)提取复合糖：将已杀菌的培养液离心去除菌体，收集上清液，加入CTAB，充分混匀，形成沉淀，离心后的沉淀物既为复合糖。2)除核酸：加入适量1mol/L氯化钙溶液，充分研磨和搅拌，使多糖与CTAB解离；加入乙醇至终浓度为25％，低温静止1-3h或静置过夜，离心收集上清液。3)提取粗糖：在上述上清液中，补加入冷却乙醇至终浓度为75％-80％，充分搅拌后，离心收集沉淀；沉淀物用无水乙醇和丙酮至少各洗一次，干燥后即为粗糖。4)多糖纯化：将粗糖溶解于适量1/10饱和中性醋酸钠溶液中；按1∶2容量用冷酚提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析或超滤除酚；加入乙醇至终浓度为75％-80％，充分搅拌后，离心收集沉淀；沉淀物用无水乙醇和丙酮至少各洗一次，干燥后即为精糖。该流程缺点是难以控制提取物中的核酸含量和蛋白质含量，难以获得符合规范的脑膜炎球菌多糖提取物，所以在该工艺上进行改进获得较高纯度的产物是有实际意义的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，其制备方法和应用。

本发明提供的脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，包含至少两种A群、C群、Y群或W135群脑膜炎球菌荚膜多糖与霍乱毒素B亚单位的偶联物。

其中，所述的至少两种A群、C群、Y群或W135群脑膜炎球菌多糖与霍乱毒素B亚单位的偶联物含量按多糖含量计算为4～8±4～8×30％μg/ml。

本发明提供的脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，还可包含药学上可接受的赋形剂，赋形剂优选为乳糖，其中所述乳糖的含量为60～80mg/ml疫苗。

本发明提供的脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，还可包含佐剂，所述佐剂为铝盐佐剂，优选为氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。其中所述的铝盐佐剂的含量(以铝含量为准)优选为0.2mg/ml疫苗。

本发明提供的脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗的制备发明，包括如下步骤：

1)往A群、C群、Y群或W135群脑膜炎球菌的培养液中加入甲醛溶液杀菌，离心去除菌体，收集上清液；

2)将步骤1)制备的上清液在8～32℃，10～2000rpm下，加入絮凝剂，pH调至5.0-7.0，在电场强度为5～30v/cm的电场中进行絮凝10～120min，固液分离获得粗制荚膜多糖；

3)将步骤2)制备的粗制荚膜多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中；用2倍体积的冷酚至少提取一次，离心收集上清液，再将上清液透析或者超滤去除酚；超速离心去除内毒素后加入乙醇至终浓度为75％-80％，充分搅拌后，离心收集沉淀；沉淀物用无水乙醇和丙酮至少各洗一次并干燥，获得精制荚膜多糖；