[发明专利]改良的等温链置换扩增

说明书

技术领域

本发明涉及在基本没有热循环下扩增核酸分子的改良方法。

技术背景

用于从核酸序列群内扩增特定序列的最常见方法是聚合酶链式反应(PCR)(Dieffenbach C and Dveksler G eds. PCR Primer：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Press，Plainview NY)。在这种扩增方法中，利用寡核苷酸在变性的单链DNA模板上引导DNA合成，所述寡核苷酸的长度通常为15-30个核苷酸，位于互补链上且在待扩增区域的两端。利用热稳定DNA聚合酶进行变性、引物杂交和DNA链合成的连续循环可指数级扩增所述引物之间的序列。RNA序列的扩增可以通过首先利用逆转录酶复制以产生cDNA拷贝来进行。可以利用包括凝胶电泳、与标记探针杂交、使用可随后鉴定(例如通过酶联检测)的标签引物、使用与靶DNA杂交时产生信号的荧光标签引物(例如Beacon和TaqMan系统)在内的多种方法检测所扩增的DNA片段。

PCR的缺点之一是需要热循环仪加热和冷却扩增混合物以使DNA变性。这样，扩增不能在原始位点进行，也不易于在实验室之外的环境中操作。

除PCR之外，还开发了其它多种用于检测和扩增特定序列的技术。其中一个实例是连接酶链式反应(Barany F Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA88：189-193，1991)。

除了依赖于扩增反应期间靶标热变性的常规DNA扩增方法外，还描述了不需要在扩增反应期间进行模板变性的很多方法，其因此被称作等温扩增技术。

等温扩增技术最早见于1992年(Walker GT， Little MC，Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system.PNAS 89：392-396，1992)，并被称为链置换扩增(SDA)。此后，还描述了很多其它等温扩增技术，包括转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，其使用RNA聚合酶以复制RNA序列而不是对应的基因组DNA(Guatelli JC，Whitfield KM，Kwoh DY，Barringer KJ，Richmann DD and Gingeras TR.Isothermal，in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication.PNAS 87：1874-1878，1990；Kievits T， van Gemen B，van Strijp D，Schukkink R，Dircks M，Adriaanse H，Malek L，Sooknanan R，Lens P. NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1infection.J Virol Methods.1991Dec；35(3)：273-86)。