[发明专利]闭合线状DNA的制备

权利要求书

1.一种用于制备闭合线状脱氧核糖核酸(DNA)的体外无细胞方法，包括：

(a)在一种或多种引物存在下，使包含至少一个原核端粒酶靶序列的DNA模板与至少一种DNA聚合酶在促进所述模板扩增的条件下接触；和

(b)使(a)中制备的扩增DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述DNA模板在通过另一条链的链置换复制来置换被复制链以促进所述模板扩增的条件下孵育。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，通过滚环扩增(RCA)来实施所述模板的扩增。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述引物是随机引物。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是SEQ ID NO：2的phi29或其变异体和/或所述原核端粒酶是SEQ IDNO：15的噬菌体N15 TelN或其变异体。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在(a)中制备的扩增DNA包括包含从所述DNA模板扩增的DNA序列的串联单元的多联体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，通过所述原核端粒酶将所述多联体分离成扩增DNA序列的单个单元。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一个原核端粒酶靶序列包含完整反转的重复DNA序列。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述DNA模板是闭合环状DNA。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述DNA模板是闭合线状DNA，优选其中所述DNA模板在变性条件下孵育以形成闭合环状DNA。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述DNA模板包括包含与感兴趣的编码序列可操作地连接的真核启动子和可选的真核转录终止序列的表达盒；其中所述感兴趣的编码序列可选地为人编码序列或来自感染人的病原体的编码序列。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述表达盒在任一侧侧接原核端粒酶靶序列。

13.根据权利要求12所述的方法，用于制备闭合线状表达盒DNA。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括纯化在(b)中制备的闭合线状DNA。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括：

(a)在约25至约35摄氏度的温度下，使具有用SEQ ID NO：15的TelN裂解并再连接的原核端粒酶靶序列的单链化的所述DNA模板与SEQ ID NO：2的phi29 DNA聚合酶或其变异体，在促进所述DNA聚合酶扩增所述模板的条件下接触；和

(b)在约25至约35摄氏度的温度下，使步骤(a)中制备的多联体与所述原核端粒酶TelN或其变异体在促进所述原核端粒酶的活性的条件下接触。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述原核端粒酶靶序列包含SEQ ID NO 25的序列或其变异体。

17.一种试剂盒，包含至少一种DNA聚合酶和至少一种原核端粒酶以及可选的在根据前述权利要求中任一项所述的方法中使用的说明书。

18.一种在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括：

-使用编码所述抗原的所述DNA模板实施根据权利要求1至16中任一项所述的方法，和

-将所得的编码所述抗原的闭合线状DNA给予所述宿主，以使所述抗原在所述宿主内表达并且诱导对所述抗原的免疫应答。

19.一种用于制备包含闭合线状DNA分子的药物组合物的方法，所述方法包括实施根据权利要求1-16中任一项所述的方法，并且将所得的闭合线状DNA与药学可接受的载体或赋形剂配制在一起。

20.闭合线状DNA分子在制备用于通过疗法治疗人或动物身体的药物中的应用，其中所述制备包括实施根据权利要求1-16中任一项所述的方法。