[发明专利]闭合线状DNA的制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于制备闭合线状脱氧核糖核酸(DNA)的体外、无细胞方法。

背景技术

用于大量扩增DNA的传统的基于细胞的方法成本较高。例如，细菌的使用需要它们在昂贵的发酵罐内大体积生长，发酵罐需要保持在无菌状态以防止培养物的污染。还需要裂解细菌以释放扩增的DNA并且需要将所述DNA从其他细菌组分中清洗并且纯化出来。特别是在制备DNA疫苗或其他治疗性DNA药物时，需要高纯度以除去对哺乳动物具有毒性的内毒素。

除了成本问题之外，细菌的使用在许多情况下为扩增方法的保真度造成困难。在细菌细胞复杂的生物化学环境中，难以控制所需DNA产物的质量和收率。细菌有时会改变克隆在扩增DNA中的所需基因并且使其对于所需目的无用。重组事件还可能会导致感兴趣的DNA的忠实制备中存在问题。用于扩增DNA的无细胞酶法避免了使用宿主细胞，所以是有利的。

例如，制备药用DNA表达盒几乎不例外地依赖于将它们插入细菌质粒并且在细菌发酵过程中进行扩增。

该现有技术方法在许多方面限制了改进此类DNA药物制备的机会。此外，质粒产物主要是粗DNA分子，因为其包含药用功能不需要的核苷酸序列。因此，在制备DNA产物例如DNA药物的领域中，需要提供用于大量扩增DNA的改进方法。特别是需要提供用于扩增特定形式的DNA例如闭合线状DNA的改进方法。由于闭合线状DNA分子与其他形式的DNA相比具有更高的稳定性和安全性，所以在治疗应用中具有特别的用途。

发明内容

本发明涉及体外、无细胞制备线状共价闭合DNA(闭合线状DNA)的方法。该方法与涉及细胞处理和在质粒内扩增的传统方法相比能够增强线状共价闭合DNA的制备。这显著增加了该方法的生产力并同时降低产品纯化的成本。

根据本发明，在无宿主细胞的条件下用酶从DNA模板制备线状共价闭合DNA。该模板DNA包含至少一个原核端粒酶(protelomerase，一种噬菌体编码的酶)靶序列。使该模板DNA与至少一种DNA聚合酶在促进该模板扩增的条件下在一种或多种引物存在下接触。使从该模板扩增的DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下接触。

因此，本发明提供用于制备闭合线状脱氧核糖核酸(DNA)的体外无细胞方法，其包括：

(a)使包含至少一个原核端粒酶靶序列的DNA模板与至少一种DNA聚合酶在一种或多种引物存在下在促进所述模板扩增的条件下接触；和

(b)使(a)中制备的扩增DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下接触。

本发明还涉及提供对于本发明方法必要的组分的试剂盒。因此，本发明提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种原核端粒酶以及本发明方法的使用说明的试剂盒。

附图说明

图1：噬菌体中线状共价闭合DNA的复制以及原核端粒酶的作用。A.染色体外噬菌体线状共价闭合DNA的示意图。*＝端粒回文序列的中心。R序列是L序列的反转回文重复。B.宿主内噬菌体DNA的复制：泡表示DNA链复制。对于R和L的互补链的合成得到了相同的双链RL序列。C.在原核端粒酶作用下形成的产物。原核端粒酶结合至RL序列并且在回文序列的中心点切割并连接相反链从而重新形成端粒并且完成原始线状共价闭合DNA的复制。

图2.大肠杆菌噬菌体N15原核端粒酶(TelN)对包含其靶位点telRL的环状双链DNA的作用。TelRL是具有由箭头指出的28bp右臂(telR)和左臂(telL)的反转回文序列。下划线示出的序列表示telRL回文序列中的缺陷。中间22bp的完整反转回文序列TelO对于酶TelN的结合是必需的。TelN在其中点裂解该22bp序列并且将互补序列的末端连接形成共价闭合末端。