[发明专利]细胞、人工细胞构建体或三维复合组织装配体的冷冻保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞和组织培养物的冷冻保存领域，更特别地，涉及细胞、细胞构建体或三维复合组织装配体的冷冻保存和长期保存的方法。该方法基于具有特定组成以及高度特定的厚度和适当机械性能的胶原细胞载体，其在解冻后保持这些特性。此类胶原细胞载体(collagen cell carrier，CCC)的使用为冷冻保存提供了一种非常适合的支持物，使其在解冻后具有非常高的存活率，并提供了已粘附在机械稳定且生物相容性支持物上的细胞和组织装配体。

本发明还涉及冷冻的胶原载体-细胞装配体和可通过本发明方法得到的冷冻人工细胞构建体或三维复合组织装配体，及其解冻后的用途。

背景技术

冷冻保存

冷冻保存在细胞的短期和长期保存中起着重要作用，因此对组织和细胞建库具有至关重要的意义。经冷冻保存的细胞(如人造血干细胞)已在白血病常规临床治疗中具有数十年的成功移植历史。利用库存组织的基于细胞的治疗也越来越多地被用于再生医学的其他领域。这些应用的巨大潜力随着新发现而不断增长，引领临床应用新产品的产生。

借助于冷冻保存技术，细胞悬液、粘附细胞甚至人工产生的组织可通过细胞库而“实时”提供。不过，此类项目的实施需要提供相应的基于细胞的再生组织以及冷冻保存系统，使粘附细胞或复合组织装配体能够以其天然三维形式在严密监控的、可再现的和成本效益高的条件下进行生产和保存。

为在冻融过程中保护细胞，向冷冻介质中加入特殊的化学物质如二甲亚砜(DMSO)、海藻糖、甘油或羟乙基淀粉(HES)。

这些所谓的冷冻保护剂保护细胞及其细胞器不受冰晶造成的膜损伤，且在水从液相转为结晶相的过程中不会产生细胞内脱水。已知冻融与细胞活力和功能的丧失有关，丧失的程度取决于所冷冻细胞的类型。在常规方法中，二甲亚砜以多至10％(v/v)的浓度单独使用或与羟乙基淀粉组合使用。DMSO主要通过降低冰点而作用于细胞内区室，这减少了冰晶的形成并因此使冷冻过程中细胞脱水程度降至最低。相比之下，大分子如羟乙基淀粉的作用则是发生于细胞外，通过形成细胞的保护性外壳而防止冷冻过程中细胞中的液体丧失。

细胞载体

除冷冻保护剂外，合适的细胞载体类型在冷冻保存过程中也非常重要。理想地，其厚度应当大致为其上所定殖细胞的厚度，即小于150μm。由于蓄热能力更强，所以更厚的细胞载体可用作缓冲，尤其是在冻融过程中，其产生对标准化冻融速率有负影响的温度梯度。当敏感且昂贵的细胞、复合细胞装配体(assembly)或基于细胞的再生组织必须被保存时，再现性和标准化变得尤为重要。冻融速率和环境压力有助于确定到达冰点时会发生何种程度的结晶。此外，必须牢记，具有一定流体吸收能力的细胞载体材料的内部也可发生结晶。更薄的细胞载体具有额外的优势，即冷冻保护剂快速渗透到内部。

几种材料已作为细胞载体用于细胞或组织的培养和/或冷冻保存。透明质酸、海藻酸、琼脂糖、纤维蛋白、几丁质/壳聚糖、聚交酯(PLA)、聚乙二醇(PGA)或聚L-乳酸(PPLA)是一些现有技术中已知用作细胞培养和/或冷冻保存的支架或载体的材料。

含有胶原的载体已被广泛用作细胞培养及其冷冻保存的基质。胶原是结缔组织(例如皮肤、血管、韧带、肌腱和软骨)结构中以及骨骼与牙齿结构中的主要成分之一。迄今为止已鉴定出超过28种在个体物种间略有差异的不同类型胶原。这一事实加上胶原降解不会产生任何毒性降解产物的事实，使得胶原具有生物相容性并在医药领域中非常有用。

不过，迄今用于粘附细胞冷冻保存的胶原细胞载体通常为水凝胶的形式，即高粘度和极高含水量的果冻状材料。所述基于胶原的水凝胶通常以不同的构造用于冷冻保存。最常见和最简单的构造为单层，即细胞或组织直接接种于包被有简单胶原凝胶单层的培养皿上。另一种广泛用于细胞或组织冷冻保存的基于胶原的水凝胶构造为三明治构造，即细胞在两层胶原凝胶之间被冷冻保存。

然而，这些基于胶原的水凝胶的缺点为其通常厚度超过150μm，这在解冻后会对细胞活力产生负影响，其原因阐释如上。此外，纯的胶原水凝胶不具备足够的机械稳定性以使得能够在解冻后可控地将构建体转移进入机体中。

因此，需要开发由解冻后具有足够机械稳定性的细胞载体支持的细胞、细胞构建体或复合组织装配体的冷冻保存方法。就再生医学而言，这将允许将细胞-载体构建体直接植入并固定在受损机体中，但同时保留胶原载体已知的在生物相容性和可降解性方面的有益作用。