[发明专利]疾病相关基因的多态性检测用探针及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测疾病相关基因的多态性的探针及其用途。

背景技术

RAS蛋白质和RAF蛋白质是形成通过RAS/RAF/MAPK通路的细胞内信号转导的级联反应的蛋白质。上述RAS/RAF/MAPK通路，RAF蛋白质被活性型RAS蛋白质活化，MEK蛋白质被活性型RAF蛋白质活化，进而MAPK蛋白质被活性型MEK蛋白质活化。由此调节细胞的增殖和分化等。

作为上述RAS蛋白质的一种的K-Ras蛋白质，是具有GTP酶活性的GDP/GTP结合蛋白质，在人体中，由位于第12染色体上的K-ras基因编码。已知上述K-ras基因在密码子12、密码子13等中突变(非专利文献1～3等)。密码子12的突变有，在序列编号1的K-ras基因的部分序列中，序列编号220的碱基(n)从鸟嘌呤(g)取代为腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)，序列编号221的碱基(n)从鸟嘌呤(g)取代为腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)。密码子13的突变有，在序列编号1的K-ras基因的碱基序列中，序列编号223的碱基(k)从鸟嘌呤(g)取代为胸腺嘧啶(t)，序列编号224的碱基(r)从鸟嘌呤(g)取代为腺嘌呤(a)。通过上述密码子12的突变，K-ras蛋白质的第12位的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、天冬酰胺(N)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)。通过上述密码子13的突变，K-ras蛋白质的第13位的甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)或半胱氨酸(C)。有报告K-ras基因的密码子12或密码子13的突变与例如大肠癌、胰腺癌等癌症、CFC(cardio-facio-cutaneous)等先天性疾病相关，与对于抗EGFR抗体药物的耐药性相关(非专利文献1～3等)。因此，在K-ras基因中，这些突变的有无，即多态性的检测，例如，对于上述疾病的诊断、更有效的疾病治疗方法的选择等至关重要。

此外，作为上述RAF蛋白质的一种的BRAF蛋白质是具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白质，在人体中，由位于第7染色体上的BRAF基因编码。有报告上述BRAF基因的突变也与上述K-ras基因相同，与上述癌症和先天性疾病相关，与耐药性相关(非专利文献1～3等)。上述BRAF基因的突变已知在序列编号2的BRAF基因的部分序列中碱基序号229的碱基(w)从胸腺嘧啶(t)取代为腺嘌呤(a)。当上述碱基为野生型(t)时，BRAF蛋白质的第600位的氨基酸为缬氨酸(V)，当上述碱基为突变型(a)时，BRAF蛋白质的第600位的氨基酸为谷氨酸(E)。据认为通过该氨基酸残基的突变，就可以获得肿瘤原性。因此，除了上述K-ras基因以外，通过检测上述BRAF基因突变的有无，即多态性，就能够进一步提高例如上述疾病的诊断以及选择更有效的疾病治疗方法等的精度。

另一方面，检测基因的多态性的方法报告了各种方法，例如，可以列举PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶链反应)-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism：限制性片段长度多态性)法等。

上述PCR-RFLP法是对于试样的靶DNA，通过PCR扩增检测目的区域，以限制性内切酶处理该扩增产物，通过DNA杂交(Southern Hybridization)印迹由多态性造成的内切酶片段长度的变化的方法。如果基因中存在目的突变，则限制性内切酶的识别部位消失，所以通过切断的有无，即，限制性片段长度的变化，就能够检测突变的有无。

然而，上述PCR-RFLP法，例如，在PCR后，需要用各种限制性内切酶处理所得到的扩增产物并进行分析，很费时间。另外，所得到的扩增产物的限制性内切酶处理，需要暂时将扩增产物取出再进行。因此，有第一次反应所得到的扩增产物飞溅而混入到第二次的其他反应中的危险。由于这样的问题，所以难以自动化进行多态性的检测。