[发明专利]用于生产高纯度神经毒素的手段和方法

说明书

本发明涉及特异性结合未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的抗体，或者特异性结合由具有如SEQ ID NO：1-16的任一项所示氨基酸序列的肽组成的表位的抗体。此外，本发明涉及用于生产神经毒素多肽的方法，包括以下步骤：将含有蛋白水解加工的、部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的混合物的溶液与特异性结合未加工的或部分加工的神经毒素多肽、但不结合加工的神经毒素多肽的试剂在允许所述试剂与未加工的或部分加工的神经毒素多肽结合的条件下接触，从而形成抗原-试剂复合物，并去除所形成的抗原-试剂复合物，从而获得含有加工的神经毒素多肽而不含未加工的或部分加工的神经毒素多肽的溶液。本发明还涉及上述抗体用于分离蛋白水解加工的神经毒素多肽与未加工的或部分加工的神经毒素多肽的用途。本发明涉及用于生产药物的方法，包括上述方法的步骤，以及将蛋白水解加工的神经毒素多肽配制成药物的其他步骤。此外，本发明涉及包含可通过上述方法可获得的蛋白水解加工的神经毒素多肽的组合物。

肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)分别产生高效价的神经毒素，即肉毒毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNT)特异性结合神经元细胞，破坏神经递质释放。每种毒素都作为无活性的未加工的约150kDa的单链蛋白质合成。翻译后加工涉及二硫键的形成和细菌蛋白酶的有限的蛋白水解作用(产生切口)。活性的双链神经毒素由两条链组成，由二硫键连接的约50kDa的N端轻链和约100kDa的重链。CNT结构上包括3个结构域，即，催化轻链、包含易位结构域(N端一半)和受体结合结构域(C端一半)的重链，参见Krieglstein 1990，Eur J Biochem 188，39；Krieglstein 1991，Eur J Biochem202，41；Krieglstein 1994，J Protein Chem 13，49。

肉毒梭菌分泌7种抗原性不同的血清型，命名为肉毒杆菌神经毒素 (BoNT)A至G。所有的血清型与由破伤风梭菌分泌的相关的破伤风神经毒素(TeNT)，都是Zn²⁺-内切蛋白酶，通过切割SNARE蛋白来阻断突触的胞吐。CNT导致在肉毒中毒和破伤风中可见的弛缓性肌肉麻痹，见Fischer 2007，PNAS 104，10447。

不论其毒性效应，肉毒杆菌毒素复合物已用作多种疾病的治疗剂。肉毒杆菌毒素A型血清型已于1989年被美国批准用于人类用途，治疗斜视、眼睑痉挛和其他病症。其可作为肉毒杆菌毒素A蛋白制剂商购，例如商标名BOTOX(Allergan Inc)、商标名DYSPORT(Ipsen Ltd)。对于治疗应用，复合物被直接注射到待治疗的肌肉中。在生理pH下，毒素从蛋白质复合物中释放，产生所希望的药理学作用。不含复合蛋白质的改良的BoNT/A制剂可以商标名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)获得。肉毒杆菌毒素的效应只是暂时的，这是维持治疗效果需要重复施用肉毒杆菌毒素的原因。

梭菌神经毒素减弱随意肌肌力，是斜视、灶性张力障碍包括颈肌张力障碍和良性自发性睑痉挛的有效疗法。其还进一步表现出缓解偏侧面肌痉挛和局部痉挛，并且对广泛的其他适应症有效，例如胃肠道功能障碍、多汗和美容纹校正，见Jost 2007，Drugs 67，669。

为了生产梭菌神经毒素，对含神经毒素的发酵溶液的纯化是特别重要的。在本上下文中，通常在不同的沉淀和提取步骤后使用浓缩步骤和其他不同的层析步骤，从而获得纯化的神经毒素，见DasGupta 1984，Toxicon 22，415；Sathyamoorthy 1985，J Biol Chemistry 260，10461。目前，可获得的神经毒素制剂除理想的活性(加工的)神经毒素外，还包括蛋白水解未加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽。蛋白水解未加工的前体或部分加工的多肽仅在少数氨基酸的序列上不同于活性(加工的)神经毒素多肽。因此，基于其化学和物理性质它们是难以区分的。另一方面，蛋白水解未加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽占总蛋白质的比例在此类制剂中仍然是显著的。所述比例是由于生物学系统，并且是由生物合成和发酵过程的条件决定的。因而，神经毒素制剂中不需要的蛋白水解未加工的前 体和/或部分加工的神经毒素多肽的量是预先确定的，且目前是难以降低的。