[发明专利]用于生物样品的细菌学研究的方法和相关设备

说明书

发明领域

本发明涉及用于生物样品的细菌学研究以鉴定样品中的细菌接种量并挑选其治疗性处理最有效的抗生素的方法，和相关设备。待分析的样品可以是例如，尿、支气管吸出物、血液、稀释的血液或其它样品。

发明背景

根据目前的国际准则，已知用于对抗生素敏感性的体外检验(抗菌谱)提供建立待针对抗生素的最优浓度(转折点)或数量稀释(MIC)来检验的标准化的细菌悬浮液。

无论检验所采用的方法的灵敏度如何，必须对分析的细菌的数目进行标准化。

接种物的制备是每个敏感性检验或抗菌谱的最关键步骤之一。接种物可显著影响抑制区域的尺寸。

根据接种物，如果所分析的细菌太少，则可能获得假敏感性结果，而由于分析太多细菌可能获得假抗性结果。

对于大多数的微生物，所用的接种物在过夜培养后应该形成半汇合的菌落。不正确的接种物(具有汇合或独立生长的菌落)可易于被识别且因此必须重复这些检验。

足够的接种物的制备在获得半汇合生长之前并不重要。

一般通过将具有相似形态的菌落中的4到5个独立菌落添加到细胞培养基并随后使其在对数期生长而制备接种物。

从4到5个菌落而非单菌落中进行挑选以使分析来源于突变体-敏感性的菌落的可能性最小化。

还可通过将在琼脂培养皿上过夜生长的菌落直接悬浮于培养基或盐溶液中而直接制备接种物。以悬浮直接制备接种物的该技术对于在培养基中以不可预测的方式生长的细菌是优选的，所述细菌例如所谓的苛养菌。

因为在接种物培养基中的生长是不可靠的，必须使用新鲜柱(从16到24小时)。

接种方法的选择主要根据实际考虑来决定，但如果采用一些标准化方法则结果较好，所述标准化方法比如以确定的浊度标准或等效的胶乳进行微生物的悬浮液的密度的对比，或通过进行光度测量。

特别地，使接种物标准化的最广泛使用的标准化方法提供了McFarland浊度标准，其通常在微生物学中用作参照来调整细菌悬浮液的浊度从而具有某个范围内的细菌数目。

McFarland标准(0.5、1、2、3、4)可通过添加特定体积的硫酸或二水氯化钡以获得具有特定光密度的硫酸钡的溶液来制备。

最常用的标准是0.5的McFarland标准，其通过将99.5mL的1％的硫酸添加到0.5mL的1.175％的二水氯化钡中，持续搅拌而制备。将该溶液分配到与用于制备接种物的那些检验管相似的检验管中，该检验管用螺旋型塞子来封闭并在室温下置于黑暗中。

0.5的McFarland标准提供了可与在含约1.5×10⁸CFU/ml的无菌盐溶液或生长培养基中的细菌悬浮液进行视觉比较的标准。

对具有微生物的被接种的培养基或直接悬浮液的待分析的检验管进行搅拌。

随后，借助于合适的光照，在具有黑色对比线的白色背景上将检验管设置于接近0.5的McFarland标准，并对比它们的浊度，观察透过悬浮液的黑色线。

如果悬浮液太浓稠，将更难以观察透过0.5的McFarland标准的黑色线。在这种情况下，利用另外的无菌培养基或盐溶液稀释该接种物。

另外，如果待检验的悬浮液太“淡”，则添加更多的微生物，或再次培养悬浮液(根据接种物制备方案)直到浊度达到McFarland标准。

经标准化后，接种物的悬浮液应在制备后的15分钟之内使用。

最近，已将胶乳颗粒的悬浮液用作硫酸钡的更简单和更稳定的替代物，以获得与McFarland标准可比的浊度。

可选地，利用分光光度计或比浊计进行标准化，这比视觉调整更便利和更准确地符合McFarland标准。

在这种情况下，在玻璃检验管中的蒸馏水中悬浮菌落从而得到具有可见浊度的悬浮液。

利用无菌的水或培养基(也用于悬浮液)将分光光度计调零到500nm。

随后，测量细菌悬浮液的吸光度，并且，从参照表中挑选待转移到5ml无菌蒸馏水中的体积，并利用具有固定体积的适宜的微量移液管来转移。

该方法取决于采用的分光光度计的类型，其可以是不同的，而且其还取决于不同尺寸的检验管或检验杯的类型的选择。

因此，为获得汇合生长，需要每次使稀释物适合于每个实验室的仪器。

如所述，还可使用比浊计，但对于不同组的微生物必须对仪器进行校准。

因此，制备接种物并将其与0.5的McFarland标准比较的已知技术带来了大量的工作，在获得所需要的最终数据时是不精确且缓慢的。