[发明专利]改进的2-酮基-L-古洛糖酸的生产

权利要求书

1.重组微生物，其包含整合的多核苷酸片段，所述片段含有编码具有L-山梨糖脱氢酶(SDH)活性的蛋白的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述多核苷酸选自下述组，所述组由：

(a)编码包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(b)包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸；

(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物组，通过核酸扩增，例如聚合酶链式反应来获得；

(d)多核苷酸，所述多核苷酸包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有SDH多肽的活性；

(e)编码SDH多肽的多核苷酸，所述多核苷酸的互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及

(f)编码SDH多肽的多核苷酸，所述多核苷酸与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少70％相同，例如85％、90％或95％相同；

构成

并且其中所述多核苷酸被整合进重组微生物的基因组中。

2.根据权利要求1的重组微生物，其中所述sdh基因进一步与外源启动子序列组合。

3.根据权利要求1或2中任一项的重组微生物，其中所述sdh基因被整合进内源质粒或染色体上的基因座中，其整合不抑制所述微生物的生长和所述sdh基因的表达。

4.根据权利要求1到3中任一项的重组微生物，其中在所述染色体上的所述基因座选自针对L-山梨糖还原酶、2-酮基-L-古洛糖酸还原酶、葡糖脱氢酶和细胞色素bd氧化酶的基因座构成的组。

5.根据前述任一项权利要求的重组微生物，其中所述微生物选自Gluconobacter、Gluconacetobacter和Acetobacter。

6.根据权利要求5的重组微生物，其是Gluconobacter oxydans，特别是Gluconobacter oxydans DSM 17078。

7.用于产生重组微生物的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)产生整合载体，所述载体包含下述多核苷酸片段，所述片段具有L-山梨糖脱氢酶基因盒的一个或多个拷贝以及整合位点的上游和下游侧翼多核苷酸序列，和

(b)产生推定的整合位点基因的敲除，这通过将(a)的整合载体引入微生物中，用根据权利要求1或2的多核苷酸片段替换所述整合位点基因来实现。

8.根据权利要求7的方法，其中在步骤(a)之后，在所述L-山梨糖脱氢酶基因引入整合位点之前，启动子被克隆于L-山梨糖脱氢酶基因之前。

9.根据权利要求7的方法，其中在步骤(a)之后，在所述L-山梨糖脱氢酶基因引入整合位点之前，标记基因被克隆进L-山梨糖脱氢酶基因的上游或下游。

10.生产2-酮基-L-古洛糖酸和/或维生素C的方法，其中使用根据权利要求1到6中任一项的微生物。