[发明专利]改进的2-酮基-L-古洛糖酸的生产

说明书

本发明涉及用于生产2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)和/或L-抗坏血酸(下文中也称为维生素C)的重组微生物(特别是Gluconobacter属的)的产生，其中该微生物已被修饰，以过量表达L-山梨糖脱氢酶(SDH)。该过量表达已通过将编码SDH的多核苷酸的一个或多个拷贝引入宿主微生物的基因组中来实现，这导致：较之未经修饰的微生物而言2-KGA和/或维生素C生产的产率、产量和/或效率提高。sdh的所述一个或多个额外拷贝的表达依赖于整合位点。本发明还涉及经遗传工程改造的微生物和它们用于生产2-KGA和/或维生素C的用途。

维生素C是对人类来说非常重要且必不可少的营养因子。维生素C还用于动物饲料，尽管一些畜牧动物可自身体内合成维生素C。

在过去的70年中，已通过公知的Reichstein方法从D-葡萄糖对维生素C进行了工业生产。该工艺中的所有步骤都是通过化学方式进行的，只除了其中一个步骤(从D-山梨糖醇到L-山梨糖的转化)，其通过微生物转化来进行。从对维生素C的工业生产的最初实践开始，就已使用了多种化学改良和技术改良，来提高Reichstein方法的效率。近来对维生素C生产的发展被概括于Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry，5^th Edition，Vol.A27(1996)，pp.547ff中。

2-KGA是用于生产L-抗坏血酸的重要的中间体。已知Acetobacter属、Gluconobacter属或Pseudomonas属的微生物可用于从D-山梨糖醇生产2-KGA。这些微生物能在生产2-KGA的需氧条件下氧化D-山梨糖醇。

可通过发酵工艺，通过属于例如Ketogulonicigenium属或Gluconobacter属的菌株从L-山梨糖起始来生产2-KGA，或者通过属于Gluconobacter属或Pantoea属的重组菌株，从D-葡萄糖起始进行另一种发酵工艺来生产2-KGA。

底物(例如D-山梨糖醇)向2-KGA的转化是涉及若干种酶(例如若干种脱氢酶)的多步工艺。D-山梨糖醇向L-山梨糖的转化，例如是通过D-山梨糖醇脱氢酶(SLDH)催化的。L-山梨糖被进一步转化为L-山梨糖酮，这由L-山梨糖脱氢酶(SDH)催化。最后，L-山梨糖酮被转化为2-KGA，该步骤通过L-山梨糖酮脱氢酶(SNDH)催化。2-KGA再被还原为L-艾杜糖酸，L-艾杜糖酸由L-艾杜糖酸脱氢酶氧化回2-KGA(Hoshino et al.Agric.Biol.Chem.Vol.54，No.9，p.2257-2263，1990)。或者，L-山梨糖酮还可被直接转化为维生素C，该步骤是通过另一类型的SNDH催化的。

可通过，例如增加转化过程中涉及的酶的活性，来增加从给定底物进行的2-KGA和/或维生素C生产。一种已被选择作为用于此类实验的目标的酶是SDH。当在给定的微生物中增加SDH-活性(例如通过引入sdh的多个拷贝)时，人们能增加目标产物(例如2-KGA或维生素C)的产量。但是，目标产物的产率仍可被改进。

本发明的一个目标是改进2-KGA和/或维生素C生产的产率和/或生产能力。

令人吃惊地，我们现在发现，在携带sdh的多个额外拷贝的宿主细胞中，2-KGA和/或维生素C生产的增加强烈地依赖于宿主细胞基因组中的整合位点。已选择了合适的基因座，其中对各基因的打断(用于sdh的整合)不对2-KGA和/或维生素C生产负面影响。

具体地，本发明的目标是产生下述微生物(例如Gluconobacter，优选Gluconobacter oxydans)，所述微生物是编码SDH的基因的二倍体，以作为通过过量表达sdh来增加L-山梨糖到L-山梨糖酮的氧化的手段。本发明涉及sdh基因的一个或多个拷贝向G.oxydans的基因组的引入，以及其使用不同的启动子的表达。合适的整合位点和启动子显示出改进了SDH的表达。

可用于本发明的编码SDH的多核苷酸可选自已知的编码SDH的基因，例如在EP 1846553中公开的，其已从Gluconobacter oxydans DSM 17078分离出。因此，本发明涉及整合于合适的宿主细胞的基因组中的编码SDH蛋白的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，其中所述多核苷酸选自下述组，所述组由：

(a)编码包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(b)包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸；