[发明专利]复合物和生产过程

说明书

技术领域

本发明涉及治疗性蛋白复合物的制备过程，以及用于该过程的装置和试剂。

背景技术

重组α-乳清蛋白的突变形式在本技术中是已知的，而且，虽然折叠和熔球形式的许多已找到的性质已显示是与天然蛋白类似，但一般认为该些突变形式的稳定性一般有所降低。部分展开态或熔球态的α-乳清蛋白本身之前一直被用以来形成生物活性复合物(斯文森等人。美国国家科学院院刊(2000)97(8)4221-4226)。

然而，本申请人发现可使用某特定类型的重组蛋白来生产具有独特组成特征和结构的治疗性活性复合物，如被n.m.r所显示。尽管有这些差异，该些复合物仍保留有用的生物活性，而且可被高效地制备。

发明内容

因此，根据本发明提供了生产生物活性复合物的方法，所述方法包含使带有α-乳清蛋白序列或其片段但缺少分子内二硫键或交联的重组蛋白在形成生物活性复合物的条件下与油酸接触，并隔离该复合物。

通过保证该重组蛋白缺少分子内二硫交联，该分子会是三维非天然的，并在其原有的内源性生物活性方面是完全非活性的。虽然这可透过其他途径，例如通过添加硫醇化合物或改变该蛋白的pH值而达成，但是也可通过例如使天然α-乳清蛋白中的半胱氨酸残基被改变为其他残基，特别是丙氨酸残基而达成。优选地，所有半胱氨酸残基被改变为其他残基，例如丙氨酸残基。

本文所使用的词语“生物活性”是指该复合物能够诱导肿瘤细胞死亡，特别是通过肿瘤细胞的凋亡，和/或具有在天然单体α-乳清蛋白形式时看不到的杀菌效果。

术语“其片段”是指会形成具有与包括完整的α-乳清蛋白氨基酸序列的复合物类似的活性复合物的该给定氨基酸序列的任何部分。片段可包含来自全长蛋白之内的不止一个部分，其连在一起。部分可适当地包含至少5个，更优选的是至少10个来自该基本序列的连续氨基酸。

合适的片段会包含长度为至少20个氨基酸，更优选的是至少100个氨基酸的缺失突变体。其包括来自该蛋白的小区域或这些区域的组合。

合适的片段会包括形成α和β结构域之间相交的区域，该区域在人α-乳清蛋白中由结构中的氨基酸34-38和82-86限定。因此，合适的片段会包括这些区域，更优选的包括该天然蛋白的氨基酸34-86的整个区域。然而，其他活性片段也可被找到。

特别是该重组蛋白为基于人α-乳清蛋白的序列，但也可使用其他来源的α-乳清蛋白，包括牛或羊α-乳清蛋白来导出该重组蛋白。

可用来使重组蛋白和油酸转化为生物活性复合物的方法与例如在第WO99/26979号和第WO2008/138348号专利中所述的方法类似，其内容以引用的方式并入本文中。然而，按照本发明的方法，明显的生物活性产物可更容易地获得好的产量。

特别是在使用本发明的方法时，可方便地得到高产量的生物活性复合物，特别是由从柱洗脱出来的单一组分得到而无需特别长的折叠过程。

以上所界定的该重组蛋白在允许离子交换的条件下，特别是当其发生在离子交换柱上，尤其是阴离子交换柱，例如DEAE-Trisacryl M柱(可购自BioSepra，，维勒纳夫，法国)，与油酸适当地接触。在将该重组蛋白应用于该柱之前，用油酸将该柱适当地“预先老化(pre-conditioned)”。这可通过首先用油酸洗脱或老化该柱而达成。适当地，该油酸在经过含有新的未被使用的离子交换材料例如DEAE Trisacryl的柱时被洗脱。合适的洗脱缓冲液包括pH值为8.5的Tris-HCl。以这种方式应用于该柱的油酸组合物的量可以是少的，视乎柱的尺寸和需要被转化为生物活性复合物的重组蛋白的体积等因素而定。例如，已发现能使用仅10mg的油酸来老化14cm x 1.6cm的柱。

在将该重组蛋白应用于该柱(例如在合适的缓冲剂的溶液中)之后，接着用线性盐梯度将其洗脱，并隔离在高盐(1M NaCl或相等物)下洗脱的组分。使用本发明的方法，大体上所有的产物都能从这一个峰获得，但先前总是需要隔离两个峰。

由于无需使表达的蛋白折叠成天然态并且无需获得并汇集多个组分，所以这大大提高了生产效率和产物的纯度。

因此，在某特定实施例中，本发明提供了生产生物活性复合物的方法，所述方法包含使带有α-乳清蛋白序列或其片段但缺少分子内二硫键(交联)的重组蛋白在阴离子交换柱形成生物活性复合物的条件下与油酸接触，用盐梯度对该柱进行洗脱，并使该复合物从在高盐浓度下洗脱的单一组分隔离出来。