[发明专利]重新设定的多能干细胞的制备

说明书

技术领域

本发明涉及多能干细胞(pluripotent cell)及其制备方法。

背景技术

据称胚胎干(Embryonic stem)(ES)细胞在保持多能性(pluripotency)的同时可以无限期地生长，并能分化成具有全部三个胚层即中胚层、内胚层和外胚层的细胞(Evans&Kaufman，Nature 292：154-156(1981))。人类ES细胞和由其衍生的细胞目前正被评估用于治疗宿主疾病如帕金森氏症、脊髓损伤和糖尿病。然而，事实上从人类胚胎中获得人类ES细胞引起了一些备受争议的伦理性考量，在许多国家这些细胞的衍生是法律所禁止的。此外，由于ES细胞和由其衍生的细胞表达衍生它们的个体中的抗原，如果施用于不匹配(例如，不能表达相似的HLA型)的个体，那么这些细胞将有被拒绝的风险。因此，科学家们已经开始寻求技术解决方案，避免用目前的方法生成ES细胞。实现这些解决方案的一个理想的方式是直接从产后个体的体细胞中生成多能干细胞，例如直接从待处理的或相关的或其他相匹配的个体中生成。

重新设定体细胞的方法之一涉及到将细胞的核内容物转移至卵母细胞中(Wilmut et al，Nature 385：810-813(1997))，或通过与ES细胞融合(Cowan et al，Science 309：1369-1373(2005))，这表明未受精的卵细胞和ES细胞中含有赋予体细胞全能性或多能性的因子。这些方法的难点包括对卵子和/或胚胎的破坏要求，这在一些国家可能引起伦理性考量。

虽然多能性的转录决定(transcriptional determination)未被完全弄明白，几种转录因子，包括Oct 3/4(Nichols et al.Cell95：379-391(1998))、Sox2(Avilion et al，Genes Dev.17：126-140(2003))和Nanog(Chambers et al，Cell 113：643-655(2003))都参与维持ES细胞的多能性；然而，没有一个能足以单独确定ES细胞的特性。

最近，Takahashi和Yamanaka向在适合小鼠ES细胞培养的条件下培养的小鼠ES细胞和小鼠成纤维细胞中引入了四种因子(即Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)。然后转导入这两种细胞类型，作者获得了诱导的多能干(induced pluripotent stem)(iPS)细胞，其表现出小鼠ES细胞的形态和生长特性，并表达了小鼠ES细胞标记基因(Takahashi&Yamanaka，Cell 126：663-676(2006))。将iPS细胞皮下移植到裸鼠的结果是产生了含有来自所有三个胚层各种组织的肿瘤。在注射到囊胚后，iPS细胞促进了小鼠胚胎发育。这些数据表明，采用逆转录病毒转导，通过只加入少量确定的因子，多能干细胞可直接从小鼠成纤维细胞培养物中产生。然而，这种技术存在一些重大的缺点，包括重新设定率低(大大低于处理细胞的1％)，需要基因整合和致癌基因c-Myc和Klf4的持续表达。这些基因的表达可能导致受体的细胞或由其衍生的细胞中产生肿瘤。在这方面，使用由这些方法产生的iPS细胞制备的嵌合体小鼠可产生肿瘤，推测可能是由于这些致癌基因的持续表达。因此，在该领域研究的主要目标是建立重新设定的方法，要么不要求对编码这些因子的核酸进行基因整合，要么最大限度地减少这些和其他重新设定因子的表达数量或时间。

大多数基于iPS细胞的研究使用成纤维细胞，主要是由于它们在基于融合的重新设定研究中容易衍生和广泛使用，各种细胞群已经在小鼠中而不是成纤维细胞用于诱导iPS细胞。这些研究中一个重要发现是，所选的体细胞类型对iPS细胞生成效率和重新设定的水平有显著的作用。在这方面，一些细胞类型，如神经干细胞、胃细胞和肝细胞，与成纤维细胞相比，表现出相对较高的重新设定效率。然而，由于组织收集的侵入性质和/或有限的捐助者样品，从人体中分离这些细胞有困难或不可行。一些更易于获得的细胞类型(例如，肌肉细胞或分化的造血干细胞)已被用来作为iPS研究，然而重新设定的成功率很有限。

因此，在该领域需要确定容易获得最佳细胞类型，以便于进行高效的重新设定。确定具有高效重新设定特性的这种细胞类型，将有助于使用无需基因整合和/或最小化或减少重新设定因子数量的重新设定方法。这将产生更安全的多能性iPS细胞群，其降低了肿瘤转化的风险。这种高效重新设定且不依赖胚胎组织获得的细胞类型，将适合应用于已经预期存在的多能性ES细胞。

发明内容