[发明专利]改善的细胞系以及在胶囊化细胞生物递送中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及表达重组蛋白的细胞系的产生，所述细胞系用于分泌性治疗分 子的裸细胞生物递送和胶囊化细胞生物递送。在一个实施方案中细胞系是人的 细胞系。

背景技术

向细胞中引入DNA的典型方法包括浓缩DNA的试剂、包含脂质的试剂以 及病毒介导的策略。然而，这些方法具有局限性。例如，浓缩DNA试剂和病 毒介导的策略存在大小限制。此外，在病毒策略中转染进入细胞的核酸的量受 限制。此外，病毒介导的策略可以是细胞类型特异性的或组织类型特异性的， 并且当体内使用病毒策略时会产生免疫问题。

克服这些问题的一个适宜的方法是转座子。转座子或转座元件是可在单个 细胞基因组内移来移去并整合在不同部位的DNA序列，这是一个称作转座的 过程。转座子包括在其上游和下游带有倒转重复序列的短核酸。活性转座子编 码称作转座酶的促进切下核酸并插入到靶DNA序列内的酶。转座子向染色体 内的整合提供了长期或可能永久在转基因细胞和生物体中表达转基因的基础。

转座子系统具有广的转基因应用范围。迄今为止，已经研究了转座子系统 在昆虫幼体内的体内蛋白质生产，其中将转座子质粒直接注射入昆虫前胚盘胚 中(WO 2001/29204)。然后从发育中的幼体或成体昆虫纯化目的蛋白质。

还已经利用转座子系统遗传修饰干细胞。WO 2009/050657涉及使用转座子 -转座酶系统产生遗传修饰干细胞的方法。在干细胞中表达的转基因是处于在干 细胞和分化细胞中均为组成型的启动子控制下的标志物基因，例如GFP。在 WO 2009/071334中，描述了使用通过转座子系统修饰的精原干细胞产生敲除或 者转基因动物模型的方法。

因此，在本领域当前技术水平众所周知，转座子可以用于产生转基因细胞 系，或者产生敲除细胞系或者产生转基因细胞系，因此改变细胞的特性。由于 转座子长期或者可能永久性整合入染色体中，所以在转基因细胞和生物体中实 现转基因表达。

在基于细胞的治疗法中，其中产生稳定的人转基因细胞系用于随后作为或 者胶囊化细胞或者裸细胞移植入受试者中，需要在植入后稳定高表达转基因， 例如在其中不能使用选择标记的条件下。有代表性地，移植的细胞和植入的胶 囊化细胞必须能够表达转基因达1年或更长，而没有任何下调，例如由基因沉 默引起的下调。传统的增强表达的工具例如密码子优化、表达增强序列的使用 或者强启动子的使用具有局限性并且可能产生变异的结果。

在本发明中，在用于植入的胶囊生产中采用了转座子系统的特性，其中所 述胶囊包含使用转座子系统改变成分泌生物活性化合物或多肽或者促进所述生 物活性肽产生的siRNA的细胞。胶囊的外膜是生物相容性的并且胶囊包含支持 细胞的基质。

发明内容

因此，在第一个方面中，本发明涉及用于向受试者递送分泌性生物活性化 合物的胶囊。胶囊包括

a.生物相容性外膜和内核，

b.所述内核包含细胞，

c.所述细胞包含含有下列结构基因的异源表达构建体

i.编码分泌性生物活性多肽的结构基因，或者

ii.编码促进细胞中产生分泌性生物活性化合物的多肽或siRNA的结构 基因，

d.所述基因位于其为转座酶或者其它整合酶底物的两个反向重复序 列之间。

该胶囊使得在植入后稳定高表达转基因成为可能，并且转座子系统的使用 与传统的细胞转染相比使转基因表达增加数倍。

在另一个方面中，本发明涉及本发明的胶囊用于治疗的用途。由于本发明 的胶囊稳定且高水平地并且在缺乏选择压力下产生生物活性化合物，它们特别 适宜于在治疗中使用。由于表达水平更高，所以可降低胶囊的数量和/或大小。

在另一个方面中，本发明涉及细胞系，包含编码下列结构基因的异源表达 构建体

i.编码分泌性生物活性多肽的结构基因，或者

ii.编码促进细胞中产生分泌性生物活性化合物的多肽或siRNA的结构基因；

所述基因位于其为转座酶底物的两个反向重复序列之间。

通过使用转座子系统产生细胞系，甚至在低拷贝数时观察到分泌多肽的增 加。因此在缺乏选择压力下达到高效率和意外的稳定转基因表达。通过使用细 胞系，保证了组合物中的所有细胞是相同的。