[发明专利]识别基因型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因多态性或体细胞突变等基因型的识别方法以及该方法中所用的试剂盒，更详细而言，涉及一种改善以利用了链置换反应的竞争性杂交来识别核酸碱基序列微小差异的方法的识别精度的方法，以及该方法中所用的试剂盒。

本申请是基于2009年3月31日在日本提出的“特愿2009-084967号”要求优先权，并在此将其内容援引到本申请中。

背景技术

通过人类基因组的解读、尤其是通过制作SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)图谱的国际人类基因组单体型图计划，有关人类基因组的信息日趋增加。并且，在全世界范围内已经大规模开展以实现下述“对应于个人遗传信息的医疗”(量身定制式医疗)作为目标的研究：通过发现所获得的基因组信息与个人体质之间的关联，掌握基因水平上的个人体质差别，可对应于个人特性进行疾病诊断、治疗、预防或施药。这里的基因差别，意指每个人的基因组碱基序列上的差别，其主要差别是单核苷酸的差别(SNP(单核苷酸多态性))。另外，最近，已了解短碱基序列的重复次数(拷贝数)的差别(拷贝数变异(Copy Number Variation，CNV))也广泛存在于全基因组中，并指出了该CNV的差别与疾病之间的关联性。

在此，为了掌握个人在基因水平上的差别，有必要调查每个人的基因型。例如，已知在某SNP中，其基因型为AA、AG、GG三种。A表示腺嘌呤、G表示鸟嘌呤碱基，该SNP是基因组位置有腺嘌呤时和鸟嘌呤时的一个例子。因此，为识别该SNP的基因型的检查，就是要确定是该三种基因型中的哪一种。即，只要发现A是0和100中的哪一个、G是0和100中的哪一个或者A和G是否为50和50即可。如此，SNP等生殖细胞突变的检测，基本可以说是定性的检测，该方法中较容易的、简便的各种方法得到实用化。

另一方面，在癌细胞中，在体细胞水平上发生突变并且该突变成为癌的诱因而与异常增殖有关。因此，在某特定种类的癌细胞中，有时会出现特定基因的突变，可以将该突变作为指标进行癌细胞的检测。但是，癌细胞富有多样性，根据一种突变来确定癌细胞则未必容易。

另外，在最近的药物疗法中，开发了以生物体内特定的分子(蛋白质等)作为目标的药剂，且发现了副作用少、效果高的药剂。它们被称作分子靶向药物，主要在癌治疗领域中得到积极的开发。最近，明确了在这些分子靶向药物中，当作为靶标的分子的信号传递的下游蛋白质中发生突变时，则该药剂的效果得不到发挥等。此时，通过调查对发生有突变的蛋白质进行编码的基因的突变，可以预测该药剂的效果，不断开拓与SNP检测不同的新型“量身定制式医疗”的领域。

在此所述的癌细胞中的特征性突变或者对分子靶向药物显示抵抗性的突变，几乎都是体细胞突变。在前述的生殖细胞突变时在所有细胞中均发现相同的突变，与此相对，在体细胞突变中只在引起突变的细胞中发现突变，在未引起突变的细胞(通常为正常细胞)中未发现突变。因此，通常在标本(作为检查对象的试样)中处于突变细胞和正常细胞相混合的状态，对应于这些细胞的丰度比(abundance ratio)，存在有突变基因和正常基因。即，若试样的大部分是正常细胞而含有部分突变细胞，则不得不从大量正常基因中检测出所存在的少许突变基因，而这就是与生殖细胞中的突变检测的不同点，使体细胞的基因变异检测变得更加困难。

在体细胞的基因变异检测法中，大致分为两种方法。其中，一种是在基因扩增阶段区别正常基因和突变基因的方法，具体而言，只对突变基因进行特异性扩增的方法。

例如，作为灵敏度最好的方法，是用限制酶只对正常基因进行切割并只对未切割的突变基因进行扩增的、被称作“mutant-enriched PCR(突变体富集PCR)”的方法(例如，参照非专利文献1)。在该方法中，通过反复进行扩增突变基因的反应，可以从正常基因10⁶分子中检测出1分子的突变基因(例如，参照非专利文献2)。该方法在这种所谓高灵敏度的方面优良，但操作非常繁杂，并不是可以适用于通常的诊断中的方法。