[发明专利]发酵工艺

说明书

技术领域

本发明涉及用于生产有价值的化合物的工业工艺。该工艺允许以具经济吸引力的产率高水平生产有价值的化合物，例如初级或次级代谢产物，药物蛋白或药物肽或工业酶。

背景技术

很多有价值的化合物是通过在大的工业规模的发酵罐中发酵生产的，即生产感兴趣的有价值的化合物的微生物在＞10m³的发酵罐中在受控条件下生长。在当前的工业规模的发酵工艺中，典型地，以微生物的生长速率为基础来选择碳源(carbon-source，也称C-source)(通常也是能源)，使得产生高的生物质比生长速率(a high biomass-specific growth rate)的碳源是优选的。一种非常常见的碳源是葡萄糖。

除了生长速率之外，碳源还可影响有价值的化合物的生产速率。在低碳源浓度下，生产速率取决于碳源浓度，使得碳源浓度的增加导致生产速率增加。但是，取决于微生物/有价值的化合物的特定组合，高于临界浓度时，碳源经常导致生产速率降低。该现象被称为“抑制”。抑制性碳源如本文下文所定义。熟知的是，葡萄糖是用于在多种条件下通过许多微生物生产代谢产物的抑制性糖。例如，Change等人(J.Industrial Microbiol.(1990)，6，165-169)描述了在用野生型Penicillium chrysogenum菌株的发酵工艺中过量葡萄糖导致青霉素V生产更低。在青霉素生产工艺发展的最初几年中已发现了下述事实：与例如乳糖相比，葡萄糖对于在分批培养中的青霉素生产而言是比较不利的碳源(例如Moyer and Coghill in J.Bacteriol.(1946)，51，57-78)。

稍后的研究显示，这些早期观测可通过下述事实解释：高于某阈值浓度时，葡萄糖抑制细胞中合成青霉素的酶的形成，而用其它碳源(包括乳糖)时该抑制不会发生(例如Revilla et al.in J.Antibiotics(1984)，37，781-789)。此类碳源因此被命名为非抑制性碳源，如本文下文将对其进一步定义的。有多种方式来避免或绕开对碳源的一般性抑制或具体对葡萄糖的抑制的抑制作用。

一种方式是分离对抑制较为不敏感的微生物的突变体。Chang等人(见上文)分离了Penicillium chrysogenum的去葡萄糖抑制型突变体，该突变体在发酵培养基中相同的葡萄糖浓度下产生较之野生型菌株而言更高的Pen-V效价。

另一种方式是在发酵过程期间保持抑制性碳源低于临界浓度。这可通过下文所述来实现：在使得发酵期间碳源浓度保持低于抑制性作用发生的值的条件下，将碳源进料到发酵罐中。Robin等人使用了限制性条件下的葡萄糖进料，用于通过经编码扩环酶基因的基因转化过的Penicillium chrysogenum菌株来生产己二酰-7-ADCA(Metabolic Engineering(2003)，5，42048 and Biotechnology and Bioengineering(2001)，83，361-368)。但是，低浓度的碳源的缺点是，微生物的生物质比生长速率(如本文下文定义的)受碳源的可利用性限制，导致生物质形成慢，并且因此导致达到有价值的化合物的期望水平的发酵时间长。使用低浓度碳源的另一缺点是，微生物的生物质比生产速率(如本文下文所定义的)仍低，又导致生产速率低。

第三种方式是完全避免使用下述抑制性碳源而改为使用已知是非抑制性的碳源，所述抑制性碳源在使用某些微生物用于生产所选择的有价值的化合物的发酵工艺中已知是抑制性的。因此，使用代替抑制性碳源的此类非抑制性碳源是有利的，因为非抑制性碳源对生产速率不具有负面作用，并且其可有利地从发酵起始在高浓度下使用，而不需要限制浓度。

但是，与在发酵开始时使用高水平的碳源相关的问题在于，产生的高生长速率经常导致不期望的高粘度的发酵液。粘度通常由两个因素确定，即，发酵液中的生物质的量(浓度)和微生物的形态(称为“生物质比粘度”，biomass-specific viscosity)。在生长速率高的工业发酵工艺中，丝状微生物(例如丝状细菌(例如Actinomycetes)或丝状真菌(例如Penicillium或Aspergillus))典型地具有分散的菌丝体(mycelium)，其具有非常长且分支的菌丝(hyphae)，这导致不期望的高的生物质比发酵液粘度。因此，即使在发酵开始时(此时仅有极少贡献于粘度的生物质，但生长速率典型地很高)，生物质比粘度可快速增加，导致发酵液中氧输送贫乏。因而低(生物质比)粘度的发酵液对于生产速率是有利的。