[发明专利]用于检测和表征产毒性艰难梭菌菌株的方法

权利要求书

1.用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌菌株的方法，其中进行下列步骤,

a. 提供样品;

b. 在多重PCR测定中,

i 就细胞毒素tcdB基因的存在或不存在分析所述样品;

ii 就tcdC基因中的一个或更多个下列缺失的存在或不存在分析所述样品,

a) SEQ ID NO. 1中核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失;

b) SEQ ID NO. 1中核苷酸301至核苷酸336的36 bp缺失;

c) SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失;

d) SEQ ID NO. 1中核苷酸313至核苷酸366的54 bp缺失;

e) SEQ ID NO. 1中位点117上的单核苷酸缺失。

2.权利要求1的方法，其中就肠毒素tcdA基因1.8 kb缺失的存在或不存在额外地分析样品。

3.权利要求1或2的方法，其中就二元毒素cdtA和/或cdtB的存在或不存在额外地分析样品。

4.权利要求1至3的方法，其中就如下方面分析所述样品,

a. 所有下列缺失的存在或不存在:

b. SEQ ID NO. 1中核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失、SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失,

c. SEQ ID NO. 1的位点117上单个核苷酸的缺失,

d. 细胞毒素tcdB基因的存在或不存在,

e. 1.8 kb tcdA缺失的存在或不存在，和

f. cdtA/B二元毒素基因的存在或不存在。

5.上述权利要求的任一项的方法，其中

a. 如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在，SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失不存在，所述18 bp缺失也不存在，所述39 bp缺失也不存在，那么所述样品被评定为产毒性艰难梭菌，

b. 如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在，SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失存在，所述18 bp缺失存在，所述cdtA/B二元毒素基因存在，那么样品被评定为核糖体型027 艰难梭菌菌株,

c. 如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失存在， SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失不存在，所述18 bp缺失也不存在，SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失也不存在，并且cdtA/B二元毒素基因不存在，那么样品被为评定为核糖体型017艰难梭菌菌株，和

d. 如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在， SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失存在，并且cdtA/B二元毒素基因存在，那么样品被评定为核糖体型078艰难梭菌菌株。

6.上述权利要求的任一项的方法，其中在反应混合物中存在荧光指示剂的情况下在封闭系统中进行所述多重扩增反应，荧光指示剂能够在扩增反应中产生与各扩增子的存在和/或量相关的光学信号和在扩增反应中监测荧光指示剂的光学信号。

7.权利要求6的方法，其中所述封闭系统为用户提供光学输出，指示权利要求5的评定分配。

8.权利要求1至6的方法，其中多重PCR测定中的所述扩增产物大小为60至200 bp。

9.权利要求1至7的方法，其中所述多重PCR扩增是定量实时PCR。

10.权利要求1至9的方法，其中所述样品是人或动物粪便。

11.包含一个或更多个通道或小室的封闭系统扩增筒，所述通道或小室包含用于扩增和/或检测(i)细胞毒素tcdB基因、(ii) tcdA基因的1.8 kb缺失、(iii)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失、(iv)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失、(v)SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失的引物和/或探针和用于检测二元毒素cdtA/B基因的引物和/或探针。

12.用于实施上述权利要求的任一项的方法的试剂盒，其包括用于扩增和/或检测(i)细胞毒素tcdB基因、(ii) tcdA基因的1.8 kb缺失、(iii)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失、(iv)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失、(v)SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失的引物和/或探针和用于(vi)检测二元毒素cdtA/B基因的引物和/或探针。