[发明专利]用于甘油三酯合成途径的基于细胞的测定

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求保护于2009年2月4日申请的美国临时专利申请序列号61/149,841的权利，该专利通过引用以其整体为所有目的结合到本文中。

发明背景

发明领域

提供了一种同时检测用稳定同位素标记的脂肪酸孵育的细胞中脂类和磷脂酸酯中间体的方法。该方法可用于以高通量形式筛选调节甘油三酯生物合成的化合物。

相关技术说明

甘油三酯或三酰甘油是真核生物主要的转运源和能量贮存。甘油三酯从一个甘油分子和三个脂肪酸分子合成而来。每个脂肪酸分子通过酯键连接到甘油分子三个羟基中的每一个。像很多中性脂类一样，甘油三酯含有各种链长的脂肪酸分子，通常长度为16、18或20个碳。

甘油三酯的两种主要生物合成途径是甘油-3-磷酸途径(主要存在于肝脏和脂肪组织中)和单酰甘油途径(主要存在于肠中)。肝脏中产生超过90％的甘油三酯的甘油-3-磷酸途径如下所示：

其中FA-CoA是脂肪酸辅酶A，GPAT是甘油-3-磷酸酰基转移酶，AGPAT是1-酰基甘油-3-磷酸-O-酰基转移酶，PAP是磷脂酸磷酸酶，DGAT是酰基辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶。

甘油-3-磷酸的生物合成途径的最后步骤可由DGAT1或DGAT2催化(Cases等1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：13018；Cases等2001 J Biol Chem 276：38870)。虽然DGAT1和DGAT2两者均能将甘油二酯转化成甘油三酯，但它们在核苷酸或氨基酸序列方面没有相似性。已有报道指出缺少DGAT1的敲除小鼠(Dgat1^-/-)肝脏没有显示明显的甘油三酯代谢变化(Smith等2000，Nat Genet 25：87)。此外，缺少DGAT2(Dgat2^-/-)的敲除小鼠肝脏显示甘油三酯的含量严重减少(Stone等2004，J Biol Chem 279：11767)。而且，研究已表明用反义寡核苷酸抑制DGAT2降低啮齿类的肝脏甘油三酯含量(Chol等2007，J Biol Chem 282：22678；Liu等2008，Biochim Biophy Acta 1781：97)，并且逆转大鼠中饮食诱导的肝脏脂肪变性和胰岛素抗性(Chol等2007，J Biol Chem 282：22678)。这些研究表明DGAT1和DGAT2在甘油三酯生物合成中功能不同。因此，特异性靶向DGAT1或DGAT2可在有限毒性下提供调节甘油三酯益处。

甘油三酯代谢的紊乱或失调与肥胖症、代谢综合征、Ⅱ型糖尿病、非酒精性脂肪肝病和冠心病的发病机理及增加的风险相关(Lewis等2002，Endocrine Reviews 23：201；Malloy and Kane 2001，Adv Intern Med 47：111)。因此，在甘油三酯生物合成途径中调节酶活性的化合物，包括DGAT1和DGAT2，可用作针对代谢疾病的潜在治疗靶标。

放射性底物和薄层层析法已广泛应用于监测甘油三酯合成(Stone等2004，J Biol Chem 279：11767；Zhu等2002，Atherosclerosis 164：221)。Stone等在原代肝细胞中用³H-甘油标记甘油三酯，并用薄层层析法和放射成像分析检测放射性同位素标记的甘油三酯(Stone等2004，J Biol Chem 279：11767)。同样地，Zhu等在人肝癌细胞中用³H-油酸标记甘油三酯，并用薄层层析法检测标记的甘油三酯(Zhu等2002，Atherosclerosis 164：221)。

最近，Magkos等用质谱技术检测中性脂类(Magkos等2007，J Lipid Research 48：1204)。Magkos等在体内给予1，1，2，3，3-²H-甘油和2，2-²H-棕榈酸酯，并通过氯仿/甲醇和超速离心从血浆中提取极低密度脂蛋白甘油三脂。Magkos等用气相层析-质谱系统检测从甘油三酯释放的标记的甘油和甲基化棕榈酸酯(Magkos等2007，J Lipid Research 48：1204)。Magkos等未检测完整的甘油三酯(如特定的甘油三酯分子)，也未检测甘油三酯途径中的不同中间体。