[发明专利]用于干细胞培养的方法和组合物

说明书

相关申请的交叉参考

该申请要求于2009年4月13日提出的美国临时专利申请系列号61/168,679的优先权，该文献的全文通过参考并入本文。

技术领域

本公开涉及细胞培养技术。具体而言，本公开涉及可用于基本未分化状态的干细胞长期培养而同时维持高生存力的培养基和培养条件。

背景技术

干细胞是可再生器官、修复组织、制备或递送生物因子以及治疗疾病或病症的潜在来源。

发明内容

在单细胞条件下，人多能干细胞(hPS)例如人胚胎干细胞(hES)和诱导的多能干细胞(hiPS)极其脆弱，这妨碍了实际应用。本公开表明，用非肌肉肌球蛋白II(NMII)的高效抑制剂(例如肌球蛋白II马达活性抑制剂(blebbistatin))处理相当大地增强了克隆密度和悬浮条件下hES和hiPS细胞的存活，并且与合成的基质一起支持用于自我更新的确定环境。

本公开通过消除培养过程中动物或人来源的细胞外基质(ECM)提供用于人诱导的多能干细胞(hiPS)和人胚胎干细胞(hES)增殖的基本上无病原体的培养环境。本公开证明了抑制肌球蛋白II增加细胞-基质粘附和细胞存活，这有效支持了hiPS和hES细胞在完全限定培养基中的化学合成的培养物质聚D-赖氨酸包被上的自我更新。因为人多能干细胞的诱导利用了与细胞维持和扩大相同的培养环境，所以该方法还可用于对于基于细胞的治疗方法所必需的完全无异源材料的新hiPS和hES细胞系的诱导。

当前的无饲养层hESC培养方法需要特定的包被，例如Matrigel^TM(基质胶)，血清成分和人细胞来源的ECM，hESC需要粘附到其上以增殖。本公开提供促进在缺乏此类包被和饲养层下的干细胞生长的培养组合物和条件。本公开至少因为下列原因影响hESC培养技术：首先，因为Matrigel^TM或人细胞来源的ECM是多种细胞外基质例如层粘连蛋白、纤连蛋白、和IV型胶原的混合物，其成分可随批次而不同，通过消除使用细胞来源的材料，可以使当前取决于包衣材料的质量和条件而高度变化的hESC繁殖过程进一步标准化；第二，由于细胞来源的生物材料从来不能够完全避免生物污染，包括病毒和抗原，不需要细胞来源的包衣将导致对GMP级hESC的生长相当有利；第三，虽然人重组ECM可以绕开潜在的污染问题，但是它们与简单地使用塑料组织培养板在制备时间、工作量和成本方面没有竞争性；以及第四，由于合成的小分子相对简单并具有稳定结构，所以对于它们转移至临床环境中认为是有利的。实际上，例如Rock抑制剂Y27632已经成功地用于临床研究。在本文中描述了用于本公开的方法和组合物中的另外的化学抑制剂。

本公开提供了包含基础培养基和肌球蛋白I I抑制剂的组合物。肌球蛋白II抑制剂可以是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。基础培养基可包含完全确定成分培养基。在一些实施方案中，组合物中还可以包括ROCK抑制剂。在某些实施方案中，组合物中可包括血清，包括与细胞类型同种异体的或者自体的血清。在又一实施方案中，组合物还可进一步包括氨基酸，例如非必需氨基酸。在另一实施方案中，在组合物中可以包括还原剂(例如β巯基乙醇)。在组合物中可以包括抗微生物剂和/或抗真菌剂。

本公开还提供包含补加有非必需氨基酸、抗氧化剂、还原剂、生长因子、丙酮酸盐和肌球蛋白II抑制剂的基础培养基的组合物。肌球蛋白II抑制剂可以是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。

本公开还提供包含聚-D-赖氨酸或者以聚-D-赖氨酸包被的组织培养板、瓶或生长基底，确定成分培养基和肌球蛋白II抑制剂的试剂盒。应当认识到，试剂盒可以如此区室化，以致于本公开的组合物可以在使用前混合。肌球蛋白II抑制剂可以是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。

本公开还提供培养干细胞(包括hiPS和ESC)的方法，包括将干细胞悬浮于包含肌球蛋白II抑制剂的培养基中；和在聚-D-赖氨酸包被的组织培养基底存在下培养干细胞。在一个实施方案中，培养基是确定成分培养基。在另一实施方案中，培养基无动物产物。