[发明专利]核酸定量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过聚合酶链式反应（PCR）进行核酸定量的领域。

背景技术

核酸的定量在从分子生物学和遗传学研究到诊断学和病原体检测的许多领域中是重要的。当足够量的核酸存在时，斑点技术可被用于定量。但是，这些技术有限的灵敏度妨碍了它们在许多情况中的应用。

不久前发展的定量PCR方法为需要更高灵敏度的情况中的分析提供了工具。这些技术基于在PCR扩增中产物的量指数增长并且因此在相对少量的循环后获得的产物的量可被传统方法（例如荧光检测）检测到的事实。此外，如果扩增循环数是已知的，原则上初始（即在扩增开始时）存在的产物的量，可从扩增结束时获得的产物的量中被确定。

简要概括，实际上，在给定的PCR反应条件下靶核酸及标准和/或对比用样品（comparative sample）进行PCR，并且PCR产物的形成在扩增程序的过程中被监控。PCR产物的检测通过例如当结合到靶标上发射特异性信号的荧光标记的杂交探针的方法或允许检测双链产物的DNA插入荧光染料的方法来完成。对获得特异地荧光阈值水平必需的扩增循环数，指定为Ct 值，被确定并且将靶标的Ct值与已知浓度（绝对量）的核酸标准品的稀释系列的Ct 值相比较。为确定靶标的绝对量，标准曲线从标准样品的Ct 值中建立并用于确定靶标的初始浓度。可选择地，靶标的Ct 值与单独的对比用兴趣核酸相比（相对定量）。在这种情况下靶标和对比用样品Ct 值的比值被确定并用于估定靶标和对比用核酸的初始量的比值。不幸地是，由于一些问题这些方法的实际应用是复杂的，这些问题中的一些将在下文中讨论。

定量PCR领域中的一些挑战涉及增长的在短时间间隔中分析大量样品的需求。由于定量PCR不断增长的应用范围需要以高通量的方式分析非常大量的样品，例如在临床实践中，开发可以完全自动化及需要非常少或无人员交互的定量PCR方法是必要的。这在一些情况中具有至关重要的价值，由于如果需要人员交互，简单地高通量应用（例如在临床实践中）无法在必需的短时间内进行。

用这种自动化方法实现的附加的好处是不同实验室之间分析数据的改进的可比较性，所述实验室普遍使用很不同的定量PCR实验室操作规程。鉴于增长的使用定量PCR技术于基础研究的实验室的数量，此问题具有极为重要的价值。建立自动化方法作为定量实验的客观参考将彻底地有助于这些研究成果。

扩增反应过程中形成的PCR产物的典型图显示了4个不同的扩增程序的阶段（参见图1）：（1）荧光信号受背景荧光和噪声控制的本底阶段；（2）来自PCR产物的信号上升超过本底水平并指数增长的指数阶段；（3）由于如PCR试剂的消耗和检测探针的降解的因素引起扩增效率降低，信号增长少于指数速度的对数线性阶段；（4）由于上升减慢及扩增反应最终停止，信号边缘上升的平台阶段。

尽管表面上简单易懂的概念，为确定Ct 值选择适当的信号阈值水平不是一个简单的任务。如可从图1的图中看到的，选择高阈值水平可导致Ct 值在扩增反应的对数线性或平台阶段。这是不合需要的，由于在此区域中反应已经从指数增长减慢下来，使初始和现有核酸量之间的关系不明显。选择低阈值水平，另一方面，可导致Ct 值定位在扩增反应的本底阶段，其中噪声和背景信号可使测量复杂化。明显地，因此，精选导致Ct 值阈值水平对应到指数增长的循环数，即在指数阶段，是令人满意的。