[发明专利]工程再造mRNA一级结构以增强蛋白质产生

说明书

优先权文件引用

本申请依据35U.S.C.§119(e)主张2009年2月24日申请的题为“Reengineering mRNA Primary Structure for Enhanced Protein Production”的美国临时申请第61/155,049号的优先权权益。上述申请的主题以全文引用的方式并入本文。

背景技术

真核生物中的翻译起始包括通过mRNA在5′帽结构或内部核糖体进入位点(IRES)上募集40S核糖体亚基和翻译机构的其它组分。40S亚基在被募集后移动到起始密码子处。关于翻译起始的一个被广泛接受的观点假设，40S亚基从募集位点移动到起始密码子，所述亚基以5′至3′方向扫描通过5′前导序列，直到遇到存在于良好核苷酸背景中的第一个AUG密码子为止(Kozak“The Scanning Model for Translation：An Update”J.Cell Biol.108：229-241(1989))。最近，已经假设翻译起始不包含扫描，但可能包含核糖体亚基束缚于帽结构或IERS上，或核糖体亚基群集于内部位点上(Chappell等人“Ribosomal shunting mediated by a translational enhancer element that base pairs to 18S rRNA”PNAS USA 103(25)：9488-9493(2006)；Chappell等人，“Ribosomal tethering and clustering as mechanisms for translation initiation”PNAS USA 103(48)：18077-82(2006))。40S亚基移动到可到达的AUG密码子处，所述AUG密码子未必是mRNA中的第一个AUG密码子。一旦亚基通过任何机制到达起始密码子处，与亚基结合的起始物甲硫氨酸-tRNA则和起始密码子进行碱基配对，大(60S)核糖体亚基进行连接，且肽合成开始发生。

因为一般认为翻译是由扫描机制起始，所以已经考虑了5′前导序列内所含的AUG密码子(称为上游AUG密码子)对翻译的影响，且已知5′前导序列内的AUG密码子可对蛋白质合成具有正面或负面影响，这取决于基因、核苷酸背景和细胞条件。举例来说，上游AUG密码子可通过使核糖体从真正起始密码子转移来抑制翻译起始。然而，翻译是由扫描机制起始的观点没有考虑编码序列中的潜在起始密码子对蛋白质合成的影响。与此相反，翻译起始的束缚/群集机制表明，编码序列中的推定起始密码子(其包括AUG密码子和非规范密码子)可被利用，从而通过与真正起始密码子竞争核糖体来降低蛋白质合成速率。

微RNA(miRNA)介导的下调作用也可对翻译效率造成负面影响。miRNA的长度一般介于21至23个核苷酸之间，并且是核糖核蛋白复合物的组分。已经表明miRNA可通过与mRNA进行碱基配对并降低mRNA稳定性、新生肽稳定性和翻译效率而对蛋白质含量造成负面影响(Eulalio等人“Getting to the Root of miRNA-Mediated Gene Silencing”Cell 132：9-14(1998))。虽然miRNA一般通过和mRNA的3′非翻译区(UTR)中的结合位点进行碱基配对来介导其作用，但已经显示所述miRNA从编码序列和5′前导序列内所含的结合位点也具有类似的阻抑作用。碱基配对是通过所谓的“种子序列”来发生，所述种子序列包括miRNA的核苷酸2至8。在人类中存在超过1,000种不同的miRNA。

mRNA编码序列和mRNA中的miRNA结合位点中的推定起始密码子的负面影响对医药工业带来挑战。举例来说，用于抗原生产、常规研究目的和基因疗法应用的蛋白质药物、DNA疫苗的工业生产都受到蛋白质合成的未达最佳速率或序列稳定性影响。蛋白质产量增加和蛋白质浓度提高可减少与工业规模培养有关的成本，降低生产药物的成本，且可促进蛋白质纯化。不佳的蛋白质表达会限制某些技术的大规模应用，例如在从DNA疫苗表达足够的抗原方面有问题，从而无法产生免疫应答以用于进行3期临床试验。

发明内容

在本领域中需要提高蛋白质翻译的效率和稳定性并提高蛋白质产量和浓度，例如在蛋白质药物的工业生产中。