[发明专利]改进的猪肝酯酶

说明书

本发明涉及经分离的突变体多肽，其具有酯酶活性，并且相对于在其氨基酸序列中没有某些突变的多肽，所述突变体多肽中如下多肽级分的浓度增大，所述多肽级分作为可溶的活性蛋白存在于在E.coli中表达的多肽的澄清裂解液中。本发明还涉及编码突变体猪肝酯酶的经分离的核酸序列和涉及根据本发明的突变体多肽的用途。

猪肝酯酶(PLEs)作为非常有用的水解酶类是已知的，例如它们在酯的对映选择性水解中是非常有用的。它们被认为有用的事实是很令人惊讶的，因为关于PLEs(从猪肝中分离的粗制裂解液)的使用具有严重的缺点。(i)有具有不同特性的多种同工酶，并且对映选择性可因此随批次而变化并且对映选择性还可由于操作稳定性的差异随反应时间变化。(ii)粗制猪肝提取物的病毒或朊病毒污染的风险对制药工业而言是主要问题。(iii)此外，利用PLEs制造的产品不可能考虑作为犹太食品(kosher)或伊斯兰食品(halal)。

因为这些限制，重组生产猪肝同工酶的多种努力是已知的。虽然最初甲醇营养型酵母毕赤酵母(Pichia pastoris)被认为是猪肝酯酶的良好的表达系统，最后证明，对有助于正确的酶折叠的具体宿主、基因和表达系统改进后的埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)是更好的宿主。

国际专利申请WO 2009/004093描述了在E.coli中的猪肝酯酶的表达，该申请通过引用被并入本文。

由于PLEs是如此有用的酶，就有进一步改进用该酶可实现的活性水平的需求。

令人吃惊地，现已发现，通过将在其氨基酸序列中的一个或多个残基(即对猪肝酯酶的多聚体形成负责的一个或多个氨基酸)替代成降低多聚体形成趋向或不会导致多聚体形成的氨基酸，因而改变PLE的四级结构，在E.coli中表达的猪肝酯酶同工形式突变体和同源酯酶的表达水平和活性水平可被显著改进。

该发现通过下述引起的：制备在编码APLE酶(SEQ ID NO 1)的开放阅读框的788位置上的突变，所述位置对应于SEQ ID NO 1中的5541核苷酸位置，其中的置换是T-＞A，这导致APLE酶中的疏水性缬氨酸被带负电荷的天冬氨酸置换：V263D。计算机模型表明该突变位于正好在酶外部的螺旋上，从而，所述突变远离酶的活性部位腔，同时还发现，该突变酶对(4E)-5-氯-2-异丙基戊-4-烯酸甲酯的总活性从6.5单位/mg总可溶蛋白增加到11.6单位/mg总可溶蛋白。在3-(3，4-二氯苯)-戊二酸二甲酯的情况下，活性从36mU/mg总可溶蛋白增加到42mU/mg总可溶蛋白，并且在乙酸对硝基苯酯的情况下，活性从15.4U/mg总可溶蛋白升至24.3U/mg总可溶蛋白。起初无法解释为什么在APLE的外部区域中的突变会对多种转化具有强的作用。但是，人同系物hCE1的结构的分析鉴别出在APLE的263位置上的缬氨酸对于对多聚化可能是重要的。当代替地引入带电荷的天冬氨酸时，以前存在的使两个亚基之间的相互作用稳定的疏水性相互作用被削弱。带负电荷的氨基酸可通过疏水性相互作用排斥而不是结合其他亚基。

接着，测试了下述假说：通过由打破疏水性相互作用的在263位置上的天冬氨酸引入的变化，多聚体形成被打破，并且因而导致多个单体形成。分析APLE的计算机模型，推断出在一个单体的263位置上的缬氨酸可与在另一个单体的43位置上的亮氨酸相互作用。假设三聚体形成至少部分地是由于在总共三个亚基之间的L43和V263的交替的疏水性相互作用。因而，不管哪个氨基酸被天冬氨酸置换，相互作用都应被打断。测试如下假说，在43位置上的亮氨酸被天冬氨酸置换，这导致单体化。

该突变还导致单体形成，因而，这证明了，在PLE单体的某些位置上的多个氨基酸的置换(没有这些置换会形成多聚体)增加了以单体形式存在的酶量，并且尽管L43D变体比V263D变体产生了更少的可溶蛋白，但下述是明显的，相对于用于同一转化的包含没有突变的酶的相同量的澄清裂解液，对于包含在涉及多聚体形成的位置上突变的酶并用于某一转化的一定量的澄清裂解液的活性增加。将相同的突变引入根据SEQ ID NO’s2、4、6、8、10、12或14的任何一条的所有多肽中，发现导致相同的作用。