[发明专利]用于检测基孔肯雅病毒的探针和引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过使用“寡核苷酸”探针利用分离自血液样品的核酸来检测基孔肯雅病毒感染的方法。本发明所采用的检测方法是实时PCR。

背景技术

基孔肯雅病毒产于热带非洲和亚洲，通过感染的蚊子叮咬传播给人类，通常是伊蚊属。基孔肯雅病毒属于多加病毒科的α病毒。它是一种“虫媒病毒”(Ar-节肢动物，bo-传播)。CHIK热(基孔肯雅热)流行病经由人类-蚊子-人类蔓延传播。单词“基孔肯雅”被认为来自当地方言所描述的与该病相关的严重的关节疼痛引起的患者的扭曲姿势。主要的病毒储存宿主是猴子，但其他物种也会受到感染，包括人类。

基孔肯雅(马孔德语指“弯曲的”)病毒(CHIKV)是一种昆虫传播的病毒，α病毒属，由病毒携带体伊蚊传播给人类。最近有CHIKV的爆发，具有较高的发病率。CHIKV引起疾病的症状类似于登革热。CHIKV显现疾病的急性发热阶段，仅持续两到五天，接着是长期的影响到四肢关节的关节痛病。CHIKV感染相关的关节疼痛持续数周或数月。

基孔肯雅病的潜伏期是两到四天。该病的症状包括高热到40C(104F)，躯干及偶尔四肢的瘀斑或斑丘疹，及影响到多个关节的关节痛或关节炎。其他非特异症状包括头痛、结膜感染及轻微畏光。典型地，发烧持续两天，然后突然结束。然而，其他症状，即关节痛、剧烈头痛、失眠与极度衰竭，持续时间不同，通常约5到7天。主诉关节痛持续时间很长的患者取决于他们的年龄。常见的实验室检查基孔肯雅包括RT-PCR、病毒分离和血清学试验。病毒分离提供了最明确的诊断，但需要1-2周完成，且必须在生物研究安全性3级实验室进行。该技术包含使具体的细胞系接触到全血样品，并识别基孔肯雅病毒特异性反应。RT-PCR应用套式引物对(nested primer pairs)，放大全血的数个基孔肯雅特异性基因。结果在1-2天确定。血清学诊断比其他方法需要更多量的血，应用ELISA试验测量基孔肯雅特异性IgM水平。结果需要2-3天，且其他相关病毒感染，如奥尼昂尼昂病毒(O’nyong’nyong)和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)时常产生假阳性。

发明内容

因此，本发明涉及有SEQ ID No.1和2的探针；有SEQ ID No.1和2在5′末端或3′末端或两处与可检测标记结合的探针；SEQ ID No.3、4、5和6的引物；用于检测基孔肯雅病毒的PCR反应混合物，所述混合物包含待检测的样品、核酸扩增试剂、选自包含SEQ ID No.1和2的组中的探针、及选自包含SEQ ID No.3、4、5和6的组中的相应引物；一种检测及可选地量化基孔肯雅感染的方法，所述方法包含以下步骤：a)形成反应混合物，包含待检测的样品、核酸扩增试剂、选自包含SEQ ID No.1和2的组中的探针、及选自包含SEQ ID No.3、4、5和6的组中的相应引物，b)使反应混合物进行PCR以获得目标序列的拷贝，然后通过测量荧光信号的增加以检测基孔肯雅感染，以及c)可选地从检测信号构建标准曲线以获得用于量化基孔肯雅感染的拷贝数；一种检测基孔肯雅感染的试剂盒，所述试剂盒包含单独地或组合地SEQ ID No.1和2的探针；单独地或组合地SEQ ID No.3、4、5和6的相应引物对，以及扩增试剂。

附图说明

图1显示基孔肯雅病毒的标准曲线。

具体实施方式

本发明涉及有SEQ ID No.1和2的探针。

在本发明的一个实施例中，所述探针用于检测基孔肯雅病毒。

本发明涉及有SEQ ID No.1和2在5′末端或3′末端或两处与可检测标记结合的探针。

在本发明的一个实施例中，所述探针在5′末端与荧光团结合，而在3′末端与猝灭剂结合。

在本发明的另一个实施例中，所述荧光团选自包含荧光素及荧光素衍生物VIC、JOE、5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、荧光黄、德克萨斯红、四甲基罗丹明、6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基罗丹明和花青染料的组。在本发明的另一个实施例中，所述猝灭剂选自包含四甲基罗丹明、4′-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4′-马来酰亚胺、四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明及黑洞猝灭剂染料的组。

在本发明的另一个实施例中，优选的荧光团是5′末端的6-羧基荧光素[FAM]，优选的猝灭剂是3′末端的四甲基罗丹明[TAMRA]。

本发明涉及引物SEQ ID No.3、4、5和6。